[發(fā)明專(zhuān)利]一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110246361.0
• 申請(qǐng)日: 2011-08-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102304574A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘球;石磊;周琳;陳濤;常彥磊;葉宇鑫;唐大運(yùn)
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 廣東省結(jié)核病控制中心;廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于臨床醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及病原微生物的診斷方法，具體涉及一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增診斷方法。

背景技術(shù)

世界衛(wèi)生組織(WHO)將結(jié)核病與艾滋病、瘧疾列為二十一世紀(jì)人類(lèi)需要攻克的三大傳染性疾病之一。目前中國(guó)結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬(wàn)，由于流動(dòng)人口數(shù)量增加，公共衛(wèi)生資源不足、公眾重視度不夠，約有5.5億人遭到感染，每年約13萬(wàn)人死于結(jié)核病。我國(guó)是全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家之一，耐藥肺結(jié)核病疫情嚴(yán)峻，每年新發(fā)耐多藥肺結(jié)核患者數(shù)約為12萬(wàn)，廣泛耐藥肺結(jié)核患者9000例。相關(guān)研究顯示，每個(gè)肺結(jié)核患者一生可以傳染10~15人，防治耐多藥肺結(jié)核，最好的辦法是盡早發(fā)現(xiàn)、盡早治療，但耐藥結(jié)核病的檢測(cè)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的生物安全要求較高，很多基層衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)無(wú)法開(kāi)展，即便在能夠檢測(cè)的部分地市或更高的衛(wèi)生服務(wù)機(jī)構(gòu)，也需要至少２個(gè)月的時(shí)間才能確診一例病例。如果耐多藥結(jié)核病和廣泛耐藥結(jié)核病患者的數(shù)量得不到有效控制，疾病的發(fā)病和死亡率將成倍增長(zhǎng)。

結(jié)核耐藥性快速診斷方法對(duì)結(jié)核病的防治具有重要價(jià)值，目前我國(guó)在結(jié)核分枝桿菌耐藥性的檢測(cè)上已有幾項(xiàng)專(zhuān)利，如結(jié)核分枝桿菌耐藥基因檢測(cè)試劑盒及其制備方法（200410083826.5）、檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥基因突變的方法和試劑盒（200610037592）等，以上方法存在操作繁瑣，所需設(shè)備昂貴等不足之處。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一組用于快速診斷耐利福平結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，及一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法。本診斷方法方便快捷、用肉眼即可判斷，價(jià)格低廉，適于推廣應(yīng)用。

為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明根據(jù)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因突變位點(diǎn)的特異性設(shè)計(jì)4條特異性引物，利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，在60~65℃下，60~90分鐘內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，并根據(jù)顯色劑顯示的顏色來(lái)區(qū)分對(duì)利福平敏感結(jié)核桿菌和耐利福平結(jié)核桿菌。

用于快速診斷耐利福平結(jié)核分枝桿菌的特異性引物，包括：

內(nèi)引物1：5’-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3’（SEQ?ID?No.1）；

內(nèi)引物2：5’-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3’（SEQ?ID?No.2）；

外引物1：5’-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3’（SEQ?ID?No.3）；

外引物2：5’-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3’（SEQ?ID?No.4）。

一種耐利福平結(jié)核分枝桿菌的診斷方法，包括如下步驟：

（1）模板DNA的制備：提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有結(jié)核分枝桿菌的樣品或分離的結(jié)核分枝桿菌；?

（2）環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)：在200μl?PCR管配制反應(yīng)體系：引物混合物1μl，反應(yīng)液?12.5μl，DNA聚合酶0.5~1μl，模板DNA?2~5μl，用滅菌去離子水補(bǔ)齊到25μl，然后加入20μl的密封液，將上述反應(yīng)管于63~65℃反應(yīng)60~90min；

所述引物混合液含有上述4條特異性引物（SEQ?ID?No.1~4），其中，內(nèi)引物1的濃度為4~8?pmol/μl、內(nèi)引物2的濃度為4~8?pmol/μl、外引物1的濃度為1?pmol/μl、外引物2的濃度為1?pmol/μl；?

所述反應(yīng)液含有10mM?dNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、150mM?MgSO₄、?5mM?Betaine，四者的體積比為7~9：5：2~4：9~11；

（3）結(jié)果判斷：在上述反應(yīng)管中加入1~2μl顯色劑SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為對(duì)利福平敏感結(jié)核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結(jié)核分枝桿菌。

優(yōu)選的，所述反應(yīng)液中，10mM?dNTP：10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液：150mM?MgSO₄：5mM?Betaine（體積比）=8：5：3：10。

優(yōu)選的，所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶，濃度為8U/μl。