[發明專利]一種耐利福平結核分枝桿菌的診斷方法

有效

• 申請號: 201110246361.0
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102304574A
• 公開（公告）日: 2012-01-04
• 發明（設計）人: 鐘球;石磊;周琳;陳濤;常彥磊;葉宇鑫;唐大運
• 申請（專利權）人: 廣東省結核病控制中心;廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.用于快速診斷耐利福平結核分枝桿菌的特異性引物，其特征在于，包括：

內引物1：5’-GTGCACCCGTCGCACTACGGGCCCGACCTCCAGGCGCTG-3’（SEQ?ID?No.1）；

內引物2：5’-GGGTCAACCCGTTCGGGTTCTGCGGTACGGCGTTTCGAT-3’（SEQ?ID?No.2）；

外引物1：5’-GCCCGGCGGTCTGTCACGTG-3’（SEQ?ID?No.3）；

外引物2：5’-GTCGGCGGTCAGGTACACGA-3’?（SEQ?ID?No.4）。

2.一種耐利福平結核分枝桿菌的診斷方法，其特征在于，采用權利要求1所述的4條特異性引物及一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在60～65℃，等溫擴增60~90分鐘，具體包括如下步驟：

（1）模板DNA的制備：提取待檢樣品的DNA，所述待檢樣品是已鑒定為含有結核分枝桿菌的樣品或分離的結核分枝桿菌；?

（2）環介導等溫核酸擴增反應：在200μl?PCR管配制反應體系：引物混合物1μl，反應液?12.5μl，DNA聚合酶0.5~1μl，模板DNA?2~5μl，用滅菌去離子水補齊到25μl，然后加入20μl的密封液，將上述反應管于63~65℃反應60~90min；

所述引物混合液含有權利要求1所述的4條特異性引物，其中，內引物1的濃度為4~8?pmol/μl、內引物2的濃度為4~8?pmol/μl、外引物1的濃度為1?pmol/μl、外引物2的濃度為1?pmol/μl；?

所述反應液含有10mM?dNTP、10×ThermoPol反應緩沖液、150mM?MgSO₄、?5mM?Betaine，四者的體積比為7~9：5：2~4：9~11；

（3）結果判斷：在上述反應管中加入1~2μl顯色劑SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應液的顏色，若呈現綠色則為對利福平敏感結核分枝桿菌，橙色則為耐利福平結核分枝桿菌。

3.根據權利要求2所述的一種耐利福平結核分枝桿菌的診斷方法，其特征在于，所述反應液中，10mM?dNTP：10×ThermoPol反應緩沖液：150mM?MgSO₄：5mM?Betaine（體積比）=8：5：3：10。

4.根據權利要求2所述的一種耐利福平結核分枝桿菌的診斷方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為Bst?DNA聚合酶，濃度為8U/μl。