[發明專利]一種快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法

無效

• 申請號: 201110246309.5
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102286623A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 鐘球;石磊;周琳;常彥磊;葉宇鑫;陳濤;唐大運
• 申請（專利權）人: 廣東省結核病控制中心;廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

技術領域

本發明涉及病原微生物的檢測與鑒定，具體涉及一種利用環介導等溫核酸擴增技術快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法。

背景技術

結核病至今仍然是全球范圍內對人類健康危害最嚴重的細菌性傳染病之一，據世界衛生組織統計，全世界現有結核病人2?000萬,每年新發生約900萬例，每年死亡300萬人，約1/?3人群有潛伏性結核分枝桿菌感染。由于人口劇增、移民增加、旅游業發展、耐藥性的產生、人類免疫缺陷病毒感染流行、吸毒、酗酒與貧困等原因，結核病呈日益嚴重回升趨勢。

至今，死菌活菌的鑒定，一直是微生物檢測的重大難題之一。由于只有活性的結核分枝桿菌才具有傳染性和侵襲力，但是目前對結核分枝桿菌的多種檢測方法，從涂片鏡檢為主的微生物學診斷方法（國家標準?GB/T?14926.48-2001），到特異抗原的免疫學檢測技術、核酸探針、聚合酶鏈式反應(PCR)技術等分子生物學檢測方法，都均難以進行結核分枝桿菌死活菌的鑒定。目前涂片技術為抗酸染色，死亡的結核分枝桿菌也能被著色，因此無法區分；免疫學檢測技術是利用抗原抗體的特異性結合，死亡的結核分枝桿菌仍然具有抗原的一般特性；作為基因診斷的PCR技術，以DNA為檢測靶點，?DNA在死亡的結核分枝桿菌樣本中仍然存在；培養技術雖然能夠區分死菌與活菌，但是結核分枝桿菌培養周期長達56日，無法滿足目前對快速檢測的要求。

疊氮溴化乙錠(ethidium?bromide?monoazide,EMA)是一種只能進入具有不完整細胞膜的死細胞中的DNA分子核酸染料。死細胞暴露于EMA僅需1min的時間，便可以滲透細胞壁或細胞膜與其中的DNA結合，使其不能發生擴增反應。

環介導恒溫核酸擴增技術（loop-mediated?isothermal?amplification?of?DNA,?簡稱LAMP）克服以往基因擴增方法的不足，在恒溫條件下能夠特異、高效、快速的核酸擴增，具有很多的優點，在63～65℃溫度下進行循環鏈置換反應，0.5至1.5小時即可進行結果判斷。

發明內容

本發明的目的在于提供一種將疊氮溴化乙錠與環介導恒溫核酸擴增技術相結合快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法，該方法檢測時間短、特異性強、靈敏度高、檢準率高，適用于臨床和疾控部門的檢測鑒定。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

一種快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法，包括如下步驟：

（1）樣品的預處理：取待檢樣品，加入終濃度為10至1000μg/mL的疊氮溴化乙錠(ethidium?bromide?monoazide，EMA)，暗處放置1~100min；然后暴露在500~1000W的鹵素燈下照射10秒~10分鐘，此過程在冰浴上進行；所述待檢樣品為已鑒定含有結核分枝桿菌的樣品或分離的結核分枝桿菌；

（2）模板DNA制備：取上述處理過的樣品，提取DNA；

（3）恒溫基因擴增反應：反應體系為25μl，包括4條特異性引物，1~10mM的dNTPs，1~10mM的MgSO₄，1~10M的甜菜堿，1~5μl?模板DNA，1~8U?Bst?DNA聚合酶，加蒸餾水至25μl，混勻；于60～65℃下，擴增60～80分鐘；

（4）結果判斷：在上述反應產物中加入1~2μl顯色劑SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應液的顏色，若顏色呈綠色則說明樣本中存在活的結核分枝桿菌，若顏色呈橙色，則說明樣本中不存在活的結核分枝桿菌；

步驟（3）所述特異性引物選自以下5組引物中任一組，其中外引物1的濃度為0.1~10mM，外引物2的濃度為0.1~10mM，內引物1的濃度為1~10mM，內引物2的濃度為1~10mM：

引物組1：

外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ?ID?No.1）

外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ?ID?No.2）

內引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ?ID?No.3）

內引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ?ID?No.4）；

引物組2：

外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ?ID?No.5）

外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ?ID?No.6）

內引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ?ID?No.7）