[發明專利]一種快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法

無效

• 申請號: 201110246309.5
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102286623A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 鐘球;石磊;周琳;常彥磊;葉宇鑫;陳濤;唐大運
• 申請（專利權）人: 廣東省結核病控制中心;廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/32
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 譚英強

1.一種快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）樣品的預處理：取待檢樣品，加入終濃度為10至1000μg/mL的疊氮溴化乙錠(ethidium?bromide?monoazide，EMA)，暗處放置1~100min；然后暴露在500~1000W的鹵素燈下照射10秒~10分鐘，此過程在冰浴上進行；所述待檢樣品為已鑒定含有結核分枝桿菌的樣品或分離的結核分枝桿菌；

（2）模板DNA的制備：取上述處理過的樣品，提取DNA作為模板DNA；

（3）恒溫基因擴增反應：反應體系為25μl，包括4條特異性引物，1~10mM的dNTPs，1~10mM的MgSO₄，1~10M的甜菜堿，1~5μl?模板DNA，1~8U?Bst?DNA聚合酶，加蒸餾水至25μl，混勻；于60～65℃下，擴增60～80分鐘；

（4）結果判斷：在上述反應產物中加入1~2μl顯色劑SYBR?GREENⅠ，混勻后觀察反應液的顏色，若顏色呈綠色則說明樣本中存在活的結核分枝桿菌，若顏色呈橙色，則說明樣本中不存在活的結核分枝桿菌；

步驟（3）所述特異性引物選自以下5組引物中任一組，其中外引物1的濃度為0.1~10mM，外引物2的濃度為0.1~10mM，內引物1的濃度為1~10mM，內引物2的濃度為1~10mM：

引物組1：

外引物1：TCATCGCCGATCATCAGG（SEQ?ID?No.1）

外引物2：CGAGTTTGGTCATCAGCCG（SEQ?ID?No.2）

內引物1：TGGTCGTAGTAGGTCGATGGGGAGTCGATCTGCACACAGCT（SEQ?ID?No.3）

內引物2：TGCGCGATGGCGAACTCAAGGCACCGTAAACACCGTAG（SEQ?ID?No.4）；

引物組2：

外引物1：ACTACGACCACATCAACCG（SEQ?ID?No.5）

外引物2：TCAGCGATCGTGGTCCT（SEQ?ID?No.6）

內引物1：CGGGCACCGTAAACACCGTACGATGGCGAACTCAAGGAG（SEQ?ID?No.7）

內引物2：AGTGTGGCTAACCCTGAACCGAGTTTGGTCATCAGCCGTTC（SEQ?ID?No.8）；

引物組3

外引物1：ACGATGGCCACCTCCA（SEQ?ID?No.9）

外引物2：CGGGTTTGATCAGCTCGG（SEQ?ID?No.10）

內引物1：CTCGCTGAACCGGATCGATGTGGAAGGCGTACTCGACCTGA（SEQ?ID?No.11）

內引物2：CAGGCATCCAACCGTCGGTTCGTCTCGGCTAGTGCA（SEQ?ID?No.12）；

引物組4

外引物1：ATCGATCCGGTTCAGCG（SEQ?ID?No.13）

外引物2：AGTAGGCAGCCTCGAGTTC（SEQ?ID?No.14）

內引物1：AGGGCTTGCCGGGTTTGATCAATGCACTAGCCGAGACGA（SEQ?ID?No.15）

內引物2：AGGATGTCGAGTTGGCCACCTCGCCGCAGTACTGGTA（SEQ?ID?No.16）；

引物組5

外引物1：GAGTCGATCTGCACACAGC（SEQ?ID?No.17）

外引物2：GAGTTTGGTCATCAGCCGT（SEQ?ID?No.18）

內引物1：TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT（SEQ?ID?No.19）

內引物2：GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTCACGGT（SEQ?ID?No.20）。

2.根據權利要求1所述的一種快速鑒定結核分枝桿菌死活的方法，其特征在于，步驟（2）中的反應體系包括0.2mM外引物1，0.2mM外引物2，1.6mM內引物1，1.6mM內引物2，?1.6mM的dNTPs，6mM的MgSO₄，1M的甜菜堿，3μl?模板DNA，?8U?Bst?DNA聚合酶，加蒸餾水至25μl。