[發明專利]表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌、其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201110245478.7
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102321547A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 王笑梅;高宏雷;高玉龍;祁小樂;秦立廷;王永強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/48;C12N15/81;C07K14/15;C12P21/02;A61K39/21;A61P31/14;C12R1/84
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

技術領域

本發明涉及一種利用基因工程技術構建的重組酵母基因工程菌株，特別涉及一種表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌，還涉及其構建方法，進一步涉及所表達的重組蛋白及其在研制新型抗禽網狀內皮組織增生病病毒的重組抗原疫苗中的應用。本發明屬于生物醫藥領域。?

背景技術

禽網狀內皮組織增生病是由禽網狀內皮組織增生病病毒(Reticuloendotheliosis?virus，REV)感染引起的，能夠導致雞體免疫抑制的一種重要的病毒病，嚴重危害著世界的養雞業。隨著該病近年來呈現的新的變化，如發病日齡升高，感染發病后死亡率升高，混合感染和繼發感染嚴重等，使得對該病的防治越來越棘手，但傳統疫苗生產難度大，病毒弱化困難，而且致弱的病毒很容易返強，使其很難在生產中安全應用。?

REV基因組編碼Gag、Pol和Env三種蛋白，囊膜蛋白env進一步分為Gp90和Gp20兩種蛋白，其中Gp90蛋白在病毒刺激機體產生中和抗體方面具有重要作用，人們利用大腸桿菌原核表達系統及桿狀病毒等真核表達系統對Gp90基因均進行了體外表達，但是由于表達產物或者不能刺激機體產生中和抗體，或者蛋白表達量低，要產生高滴度抗體需要多次加強免疫，因此，從經濟的角度考慮，不適合用于大規模商業化生產。?

本項目所利用的甲醇酵母具有表達產物活性高，生產規模容易放大，成本低廉等特點，使得利用該系統開發禽網狀內皮組織增生病亞單位疫苗具有很好應用前景。本申請所應用的疫苗具有上述價廉，生物活性好等優點，能夠為防制當前流行的禽網狀內皮組織增生病提供確實、有效的工具和手段，并可為防制禽類免疫抑制病提供有效的參考和經驗。由于新型疫苗相對于傳統疫苗具有更低的成本，這將為該疫苗的應用創造了一個很好的條件，投入應用后既能有?效的防止疫病造成的損失，同時也降低了養殖成本。該疫苗的研制將創造更大的經濟效益和社會效益。?

發明內容

針對上述問題，本發明所解決的第一個技術問題是提供一種表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌株，其特征在于所述菌株為重組巴斯德畢赤酵母(Pichia.pastoris)SMD1168工程菌株，該菌株(pPIC9KrREVgp90/SMD1168)保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為：CGMCC?5046，保藏日期為2011年7月8日；?

本發明所解決的第二個技術問題是提供一種構建以上所述的重組酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步驟：?

(1)Gp90基因的擴增?

以禽網狀內皮組織增生病病毒REV/HLJR0901的基因組為模板，GenBank登錄號為GQ415646，設計特異性擴增引物，擴增出Gp90基因序列，如SEQ?IDNO：1所示；所述的HLJR0901株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址在北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所，其菌種保藏編號為：CGMCC?5015，保藏日期為2011年7月8日；?

(2)將擴增出的片段插入畢赤酵母表達載體pPIC9K中，構建成重組質粒pPIC9k-Gp90，電轉化酵母SMD1168感受態細胞，抗生素篩選，PCR鑒定，得到重組酵母菌株；?

(3)對重組酵母菌株進行誘導表達，篩選得到穩定表達的高表達菌株，并將其馴化為工程菌株，即得。?

其中所述的引物序列可為：?

Gp90F：5’AGCTACGTAATGGACTGTCTCACC?3’?

Gp90R：5’AGAGCGGCCGCTTAATGATGATGATGATGATGCTTATGACGCCCAGC3’?

本發明所解決的第三個技術問題是提供所述的重組酵母工程菌株在表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白中的應用。?

本發明所解決的第四個技術問題是提供一種由所述的重組酵母基因工程菌株表達的禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白；及所述的重組蛋白在制備預防禽網狀內皮組織增生病疫苗藥物中的應用。?

本發明所解決的第五個技術問題是提供一種預防禽網狀內皮組織增生病的重組抗原疫苗，其特征在于包含有效劑量的本發明所述的重組酵母基因工程菌株表達的重組蛋白和藥學上可接受的載體以及所述的重組抗原疫苗在制備預防禽網狀內皮組織增生病藥物中的應用。?

本發明所解決的第六個技術問題是提供了一種使用本發明所述的重組酵母菌株進行發酵的方法，其特征在于包括以下步驟：?