[發明專利]表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌、其構建方法及應用

有效

• 申請號: 201110245478.7
• 申請日: 2011-08-25
• 公開（公告）號: CN102321547A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 王笑梅;高宏雷;高玉龍;祁小樂;秦立廷;王永強
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/48;C12N15/81;C07K14/15;C12P21/02;A61K39/21;A61P31/14;C12R1/84
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨

1.表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90蛋白的重組酵母工程菌株，其特征在于所述菌株為重組巴斯德畢赤酵母(Pichia.pastoris)SMD1168工程菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCC?5046。

2.構建權利要求1所述的重組酵母工程菌株的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)Gp90基因的擴增

以禽網狀內皮組織增生病病毒REV/HLJR0901的基因組為模板，GenBank登錄號為GQ415646，設計特異性擴增引物，擴增出Gp90基因序列，如SEQ?IDNO：1所示；所述的HLJR0901株保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其菌種保藏編號為：CGMCC?5015；

(2)將擴增出的片段插入畢赤酵母表達載體pPIC9K中，構建成重組質粒pPIC9k-Gp90，電轉化巴斯德畢赤酵母SMD1168感受態細胞，抗生素篩選，PCR鑒定，得到重組酵母菌株；

(3)對重組酵母菌株進行誘導表達，篩選得到穩定表達的高表達菌株，并將其馴化為工程菌株，即得。

3.權利要求1所述的重組酵母工程菌株在表達禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白中的應用。

4.由權利要求1所述的重組酵母基因工程菌株表達的禽網狀內皮組織增生病病毒Gp90重組蛋白。

5.權利要求4所述的重組蛋白在制備預防禽網狀內皮組織增生病疫苗藥物中的應用。

6.一種預防禽網狀內皮組織增生病的重組抗原疫苗，其特征在于包含有效劑量的權利要求4所述的重組蛋白和藥學上可接受的載體。

7.權利要求6所述的重組抗原疫苗在制備預防禽網狀內皮組織增生病藥物中的應用。

8.一種使用權利要求1所述的重組酵母工程菌株發酵的方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)取權利要求1所述的重組酵母工程菌株1ml接種于50ml?MGY培養基中，30℃300rpm培養至OD₆₀₀為2-6時，接入發酵罐中，用基礎鹽培養基進行發酵培養；

(2)轉速級聯到溶氧控制上，維持溶氧40％，溫度30℃，pH?6.0，培養20-24h，待溶氧升高，轉速下降時補加50％甘油，補加速度為15ml/L·h，補加4個小時，隨后進入甲醇誘導期，開始甲醇補量為3.5ml/L·h，此階段持續2～5h，隨后根據發酵情況適度增加甲醇補量；

(3)發酵72小時后收獲上清，進行SDS-PAGE和Western?blot分析，并進行蛋白濃度測定。

9.如權利要求8所述的重組酵母工程菌株發酵的方法，其特征在于所述的基礎鹽培養基按照以下方法配制：26.7mL?85％H₃PO4，0.93g?CaSO4·2H₂O，18.2g?K₂SO₄，14.9g?MgSO₄·7H2O，4.13g?KOH，40g甘油溶解于去離子水中，定容至1L；高壓滅菌后，pH為1～1.5，溫度降到30℃后，用30％NH₄OH調pH至5.0。