[發(fā)明專利]可利用木糖發(fā)酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌及其育種方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110242299.8
• 申請日: 2011-08-23
• 公開（公告）號: CN102433321A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳樹林;郭蔚;馬延和
• 申請（專利權(quán)）人: 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所;中國科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/03
• 分類號: C12N15/03;C12N1/20;C12R1/225
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種乳酸菌的育種方法，特別是涉及一種能夠利用木糖發(fā)酵且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法。?

背景技術(shù)

乳酸在醫(yī)藥、食品、日用化工等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，它是一種重要的平臺化合物，可轉(zhuǎn)化為多種化合物如丙烯酸、丙二醇、乙醛和乙酰丙酮。近幾年來，隨著乳酸及其衍生物在生物可降解塑料及綠色環(huán)保溶劑中的應(yīng)用，工業(yè)上對乳酸的需求也逐漸增加。?

目前，全世界的乳酸年產(chǎn)量約為20-25萬噸，其中90％均選育特定的微生物用發(fā)酵法生產(chǎn)。乳酸發(fā)酵多采用大米、玉米等淀粉質(zhì)原料發(fā)酵，但發(fā)酵生產(chǎn)成本較高。以谷物或玉米為原料大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)乳酸作為聚乳酸合成前體會大量消耗糧食，加劇糧食與飼料資源的緊張狀況。采用廉價易得，來源廣泛的木質(zhì)纖維素為原料來發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，不僅能夠降低乳酸發(fā)酵的原料成本，而且具有深遠的環(huán)境與社會意義。?

木質(zhì)纖維素物質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，決定了木質(zhì)纖維素乳酸工藝的復(fù)雜性。因此需要篩選和構(gòu)建具有一定特性的菌種，以滿足木質(zhì)纖維素乳酸工藝的特殊條件如：能夠同時利用葡萄糖和木糖，能夠耐受木質(zhì)纖維素稀酸水解液中的抑制物，能夠耐高溫等。一些研究報道了部分可利用木糖的乳酸菌如戊糖乳桿菌(Lactobacillus?pentosus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus?casei?ssp.Rhamnous)、冷凝芽孢桿菌(Bacillus?coagulancs)和基因工程大腸桿菌(E.coli)利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)乳酸的研究。但是這些菌株或者存在葡萄糖阻遏(carbon?catabolic?repression，CCR)效應(yīng)，如干酪乳桿菌優(yōu)先利用木質(zhì)纖維素水解液中的葡萄糖，待葡萄糖消耗殆盡才開始緩慢利用木糖；或者存在水解液抑制物不耐受的問題。據(jù)報道，稀酸水解液中已確認的抑制物多達?35種，抑制物的濃度隨著預(yù)處理的水解程度的增加而增加。如當(dāng)水解液中的木糖含量達到5g/l時，干酪乳桿菌的生長就因水解液中的抑制物受到抑制。冷凝芽孢桿菌雖然能夠同時利用水解液中的葡萄糖和木糖，但是當(dāng)水解液中的木糖含量達到35g/l時，其生長就因水解液中的抑制物而受到阻遏。盡管一些脫毒處理的方法如生物法，化學(xué)法被提出來，但是勢必增加乳酸發(fā)酵的成本。而通過誘變或基因修飾的手段，雖能夠改善部分木糖利用菌株如E.coli的葡萄糖阻遏效應(yīng)，但其同時代謝葡萄糖與木糖的能力與不存在葡萄糖阻遏的野生型菌株相比，還是相去甚遠。短乳桿菌是一種不存在碳代謝阻遏(carbon?catabolic?repression，CCR)效應(yīng)，可同時代謝葡萄糖與木糖，而且能夠耐受木質(zhì)纖維素水解液抑制物的一種天然的乳酸菌，在木質(zhì)纖維素的生物煉制方面具有極大應(yīng)用潛力。同步糖化發(fā)酵(SSF)是實現(xiàn)木質(zhì)纖維素生物煉制最理想的一種發(fā)酵工藝。該工藝需要菌株具備耐受45～50℃高溫的特性，以配合纖維素酶的水解，使同步糖化發(fā)酵工藝的效率達到最高，從而降低纖維素酶的使用量，進而降低成本。而大部分可利用木糖的乳酸菌如短乳桿菌為嗜溫菌，不耐受45～50℃高溫。因此需要對短乳桿菌進行改造，提高其溫度耐受性，使其更適于木質(zhì)纖維素發(fā)酵的工藝條件。但是微生物的耐高溫機制復(fù)雜，往往涉及多個基因，單個或少量基因的表達或缺失，不能達到提高菌株的溫度耐受性。同時，目前關(guān)于短乳桿菌的遺傳背景，代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究尚處于起步階段，沒有建立成熟的基因改造技術(shù)，僅有少量的文章報道了關(guān)于短乳桿菌的代謝工程改造的報道，效果亦不理想。?

原生質(zhì)體融合雜交育種被證明是一種可以應(yīng)用于乳酸菌的良好的育種技術(shù)。但是該方法一般首先需要對融合的兩親本進行誘變，以獲得合適的遺傳標(biāo)記。但是在誘變過程中往往可能將親本的優(yōu)良性狀相關(guān)的基因破壞或丟失，從而影響融合子優(yōu)良基因的獲得。?

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明設(shè)計了一種針對可利用木糖的乳酸菌，主要是短乳桿菌的一種育種方法。?

本發(fā)明提供的關(guān)于可利用木糖的乳酸菌，如短乳桿菌的育種方法，主要包括以下步驟：?

1)選擇一種能夠耐受45～55℃高溫，不具備木糖利用能力的乳酸桿菌，制備原生質(zhì)體。?

2)培養(yǎng)可利用木糖的乳酸菌制備原生質(zhì)體。?

3)將上述獲得的兩種原生質(zhì)體進行融合。?

4)選擇合適的原生質(zhì)體再生條件，獲得融合子。?

上述方法中，所述可利用木糖的乳酸桿菌可為短乳桿菌，植物乳桿菌，具體可為短乳桿菌。?