[發明專利]可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌及其育種方法

有效

• 申請號: 201110242299.8
• 申請日: 2011-08-23
• 公開（公告）號: CN102433321A
• 公開（公告）日: 2012-05-02
• 發明（設計）人: 陳樹林;郭蔚;馬延和
• 申請（專利權）人: 天津工業生物技術研究所;中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N15/03
• 分類號: C12N15/03;C12N1/20;C12R1/225
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 史霞

1.一種可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，包括以下步驟：

步驟一、將可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌進行原生質體的制備，以及將可以耐受高溫的乳酸菌進行原生質體的制備；

步驟二、將上述步驟一中獲得的可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌的原生質體和可以耐受高溫的乳酸菌的原生質體進行融合；

步驟三、將上述步驟二中獲得的原生質體融合液混入再生培養基，進行再生，最終獲得可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌。

2.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，所述可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌為植物乳桿菌，戊糖乳桿菌，和/或短乳桿菌。

3.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，所述耐受高溫的乳酸菌為德氏乳桿菌、保加利亞乳桿菌和/或鼠李糖乳桿菌。

4.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌可利用木糖，但不耐受高溫的特性，作為其遺傳標記，利用可以耐受高溫的乳酸菌可耐受高溫，但不能利用木糖的特性，作為其遺傳標記，以木糖的可利用性與耐受高溫性作為融合乳酸菌的篩選壓力，篩選融合乳酸菌。

5.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，可以耐受高溫的乳酸菌能夠耐受45～55℃的高溫。

6.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，在所述步驟一中，將可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌進行原生質體的制備的方法包括：將可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌通過培養基進行培養，在光密度OD達到0.6時，收集培養物，再用Tris-LBP緩沖液重懸，使菌體量達到10⁹，加入3～8mg/ml溶菌酶，15～25U/ml變溶菌素，在35～39℃的條件下，酶解30～60分鐘，直到原生質體形成率達到90％時，收集菌體，其中，Tris-LBP緩沖液包括：Tris?10mM、CaCl₂20mM和蔗糖0.5M，其中pH?6.3。

7.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，在所述步驟一中，將可以耐受高溫的乳酸菌進行原生質體的制備的方法包括：將可以耐受高溫的乳酸菌通過培養基進行培養，在光密度OD達到0.6時，收集培養物，使菌體量達到10⁹，再用HEPE-LBP緩沖液重懸，加入15～25mg/ml溶菌酶，180～220U/ml變溶菌素，在35～39℃的條件下，酶解60～120分鐘，直到原生質體形成率達到90％時，收集菌體，其中，HEPE-LBP緩沖液包括：HEPE?10mM、MgCl₂20mM和蔗糖0.5M，其中pH?7.3。

8.根據權利要求1所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，在所述步驟二中，將可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌的原生質體和可以耐受高溫的乳酸菌的原生質體進行融合的方法包括：將兩種原生質體混勻，加入900μl的促融劑振蕩混勻，所述促融劑為50％的PEG緩沖溶液。

9.根據權利要求6或7所述的可利用木糖發酵乳酸且耐高溫的融合乳酸菌的育種方法，其中，可利用木糖發酵生成乳酸的乳酸菌的培養基為：木糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0.5g/l、硫酸錳0.02g/l；和/或可以耐受高溫的乳酸菌的培養基為：葡萄糖20g/l、蔗糖171g/l、蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、牛肉膏4g/l、檸檬酸銨2g/l、磷酸氫二鉀2g/l、無水乙酸鈉3g/l、硫酸鎂0.5g/l、硫酸錳0.02g/l。

10.一種根據權利要求1～9中任一項方法育種的融合乳酸菌，其中，所述融合乳酸菌可利用木糖發酵產生乳酸，同時可耐受42～50℃的高溫。