[發明專利]生產伽馬-羧化的蛋白的方法

有效

• 申請號: 201110241382.3
• 申請日: 2004-10-12
• 公開（公告）號: CN102443548A
• 公開（公告）日: 2012-05-09
• 發明（設計）人: C·芬格;A·勒夫格倫;A·特林
• 申請（專利權）人: 阿斯特拉曾尼卡有限公司
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N5/10;C12N15/81;C12N15/85;C12P21/02;C12N9/74;C07K14/745;C07K14/47;A61K38/48;A61K38/36;A61K38/17;A61P7/04
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 權陸軍;劉健

本申請是國際申請日為2004年10月12日的國際申請PCT/SE2004/001453進入中國、申請號為200480030037.3的題為“生產伽馬-羧化的蛋白的方法”的發明專利申請的分案申請。?

技術領域

本發明涉及包含表達載體的宿主細胞，所述表達載體包含編碼需要伽馬-羧化作用的蛋白的核酸分子和相連的包含第一啟動子的表達控制序列，和編碼γ-谷氨酰羧化酶的核酸分子和相連的包含第二啟動子的表達控制序列。本發明進一步涉及以高產量生產需要γ-羧化作用的蛋白的方法。?

背景技術

出血是常見的臨床問題。它是疾病、外傷、手術和藥物治療的結果。機械性地阻止出血是必要的。由于出血的位置或由于從許多(小)脈管散開，這是非常困難的或甚至是不可能的。因而出血的病人可能需要用支持止血的試劑治療。這可以是血液衍生產品(血治療，heamotherapy)、引起內源止血劑的釋放的試劑、重組凝結因子(F)或延遲血液凝塊分解的試劑。?

通常從地方醫院獲得的血液衍生產品之中第一線的治療(first?line?treatment)是用于容量置換和支持止血的全血，包裝的紅細胞用于改善氧轉運容量，血小板濃縮物以提高血小板數量(如果數量低或有缺陷)和新鮮的冷凍血漿用于支持止血(血液凝結和血小板聚集)。支持止血的第二線的血漿衍生產品是血漿冷沉淀物、凝血酶原復合物濃縮物、活化的凝血酶原復合物濃縮物和純化的凝結因子。作為人類重組蛋白，無活性的(凝結因子VIII和IX)和活化的(凝結因子VIIa)，一些凝結因子當今是可獲得的。?

血友病是遺傳的或后天的出血失調，有異常的或缺陷的凝結因子或抑制促凝血功能的針對凝結因子的抗體。最常見的血友病是血友病A(缺乏凝結因子VIII)和血友病B(因子IX)。提純的或重組的單?獨的凝結因子是血友病病人的主要治療手段。有抑制性抗體的病人遇到了治療難題，因為抗體也可以中和向該病人施用的凝結因子。通過降解活化的凝結因子Va和VIIIa，蛋白C的活性形式(APC)是血漿凝結的抑制物。已經顯示重組的APC是敗血癥病人中不適當的血漿凝結的有效治療手段。?

盡管純化過程并不簡單和需要許多步驟，某些步驟目的在于消除污染的病毒，用于治療用途的凝結因子可以從人類血漿獲得。但是盡管有血液衍生產品的大量的安全性測量和測試，也無法排除感染性病毒或朊病毒的污染。由于這種風險，非常期望從無動物衍生成分的培養基中生長的重組細胞中產生人類治療性蛋白。這不總是簡單的，因為許多蛋白需要哺乳動物宿主來以完全功能性的形式產生，即，被正確地翻譯后修飾。在重組細胞中商業化生產的凝結因子有FVII(NovoSeven)、FVIII(Kogenate，Recombinate，Refacto)和FIX(BeneFix)(Roddie?and?Ludlam.Blood?Rev.11：169-177，1997)和Active?Protein?C(Xigris)。在獲取大量的全功能重組人凝結因子時的一個主要障礙在于FII、FVII、FIX、FX和蛋白C中存在的Gla結構域。這個結構域含有通過添加羧基基團翻譯后修飾的谷氨酸殘基。這些因子的生產受到如下事實的妨礙，即它們的過量表達引起羧化不足，由此產生無活性的蛋白。Gla修飾是被稱為γ-谷氨酰羧化酶(GGCX)的維生素K依賴性酶的作用的結果。許多科學家，特別是那些致力于凝結因子研究的科學家已經對這個酶進行了廣泛的研究(WO-A-8803926；Wu?et?al.Science?254(5038)：1634-1636，1991；Rehemtulla?et?al.，Proc?Natl?Acad?Sci?USA?90：4611-4615，1993；Stanley?J.Biol.Chem.274(24)：16940-16944，1999；Vo?et?al.，FEBSletters?445：256-260，1999；Begley?et?al.，The?Journal?of?Biological?Chemistry?275(46)：36245-36249，2000；Walker?et?al.，The?Journal?of?Biological?Chemistry?276(11)：7769-7774，2001；Bandyopadhyay，et?al.Proc?Natl?Acad?Sci?USA?99(3)：1264-1269，2002；Czerwiec?et?al.，EurJ?Biochem?269：6162-6172，2002；Hallgren?et?al.，Biochemistry?41(50)：15045-15055，2002；Harvey?et?al.，The?Journal?of?Biological?Chemistry?278(10)：8363-8369，2003)。至少兩個科學團隊已經進行了通過與凝結因子FIX共表達GGCX來提高產量的嘗試，但是沒?有成功(Rehemtulla，et?al.1993，ibid；Hallgren?et?al.2002，ibid)。考慮到在γ-羧化蛋白方面的巨大興趣，可以推測有更多的共表達試驗失敗了并因此沒有被報道。?