[發明專利]豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒

無效

• 申請號: 201110240542.2
• 申請日: 2011-08-22
• 公開（公告）號: CN102277454A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 袁秀芳;王一成;徐麗華;李軍星;劉鄧
• 申請（專利權）人: 浙江省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;G01N21/64
• 代理公司: 北京正理專利代理有限公司 11257
• 代理人: 張文祎

技術領域

本發明涉及豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測用引物、探針及檢測試劑盒。

背景技術

豬流行性腹瀉病毒(Porcine?epidemic?diarrhea?virus，PEDV)和豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible?gastroenteritis?virus，TGEV)是引起仔豬腹瀉的主要腸道病毒，二者均屬冠狀病毒科、冠狀病毒屬的病毒，單鏈正股RNA病毒，都能造成腸絨毛的萎縮或變短，均有類似的傳染途徑和臨床癥狀，感染豬均表現為水樣腹瀉、嘔吐、脫水及新生仔豬的高死亡率。在全世界范圍內廣泛發生。由于傳染性胃腸炎和流行性腹瀉的臨床表現、病理變化、流行病學等方面都非常相似，但兩病原沒有共同的抗原性，不能交互免疫，而又有混合感染，因此給這兩種病的診治和預防帶來了一定困難。診斷這兩種疾病的傳統方法有病毒分離、電鏡檢測、熒光抗體檢測、免疫組織化學法等。雖說上述方法能夠鑒別診斷這兩種病，但由于實驗方法的限制，導致檢測耗時過長，無法在病毒感染初期進行診斷。近年來，隨著分子生物學的發展，反轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)在PEDV和TGEV檢測方面的應用越來越廣泛，與傳統的方法相比較，RT-PCR方法更加敏感、快速、方便，但步驟繁雜、假陽性較多、缺乏準確定量、靈敏度不夠高等妨礙了RT-PCR在實際臨床中的應用。1995年美Perkin?Elmer公司研制出新的實時熒光定量PCR(fluorescent?quantitative?PCR，FQ-PCR)技術，從而一舉解決了常規PCR的諸多不足之外，使PCR技術得到更新和發展，從而廣泛地應用于臨床以及其它相關核酸的研究。

本發明首次將熒光RT-PCR技術應用于同時檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒檢測領域，提供了針對豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的特異性引物、探針序列、試劑盒和檢測方法。

發明內容

本發明要解決的第一個技術問題是提供一組特異性強、靈敏度高的同時檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的核苷酸序列，包括引物和探針。

本發明要解決的第二個技術問題是提供快速、準確、使用方便的檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

本發明提供了檢測豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的引物和探針，具體如下：

通過序列比較，根據豬傳染性胃腸炎病毒TGEV?Miller?M6株N基因的序列（GenBank：DQ811785），在其保守區27832-27938位置設計一對引物及一條探針：

1）TGEV正義引物（TGEV-F）?5'ACAATTCCTTCAGCAGATTAATGC3'?（SEQ?ID?NO：1）；

2）TGEV反義引物（TGEV-R）5'CCTCTTGCTCTGACCTTTCTG3'?（SEQ?ID?NO：2）；

3）TGEV探針（TGEV-probe）5'(JOE)?ATGCTCGYCCATCAGAAGTGGCAAA?(TAMARA)?3'（SEQ?ID?NO：3），該探針的5’端標記報告熒光基團JOE，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA；

其中，Y代表兼并堿基T或C；擴增目的片段為107bp。

通過序列比較，根據豬流行性腹瀉病毒PEDV?CV777株N基因的序列(GenBank：AF353511)，在其保守區27163-27348位置設計一對引物及一條探針：

4）PEDV正義引物（PEDV-F）5’AACAAATCCAGGGCCACTT3’?（SEQ?ID?NO：4）；

5）PEDV反義引物（PEDV-R）5’TAAACTGGCGATCTGAGCA3’?（SEQ?ID?NO：5）；???????????????????????

6）PEDV?探針（PEDV-probe）

5’?(FAM)?TCAAAGACATCCCAGAGTGGAGGAGAAT?(TAMARA)?3’?（SEQ?ID?NO：6），該探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA?；

擴增目的基因大小為186bp。

本發明還提供了一種豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒的檢測試劑盒，由以下組分組成：