[發(fā)明專利]羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110239776.5
• 申請日: 2011-08-19
• 公開（公告）號: CN102277453A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 潘曉藝;沈錦玉;郝貴杰;姚嘉赟;徐洋;尹文林;曹錚
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江省淡水水產(chǎn)研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州浙科專利事務(wù)所 33213
• 代理人: 吳秉中

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于靶DNA片斷的檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated?isothermal?amplification,?LAMP)技術(shù)快速檢測羅氏沼蝦雙順反子病毒所用的試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

羅氏沼蝦雙順反子病毒（Macrobrachium?rosenbergii?dicistrovirus，MRDV）是引起羅氏沼蝦幼體綜合癥（Macrobrachium?rosenbergii?larval?Syndrome，MRLS）的主要病原，對羅氏沼蝦育苗產(chǎn)業(yè)危害極大。MRDV為單正鏈RNA病毒，歸為雙順反子病毒科。該病毒在國內(nèi)外文獻(xiàn)上未有報道，其基因組序列僅公開了900個堿基。該病毒于2009年和2010年引起我國羅氏沼蝦幼體的疾病，造成羅氏沼蝦在幼體期出現(xiàn)大量死亡，特別是在幼體6-9日齡死亡尤為嚴(yán)重，死亡率一般為80-90%，嚴(yán)重的達(dá)到100%，近2年造成的經(jīng)濟(jì)損失無法估量。被發(fā)現(xiàn)以來，因缺少檢測方法，嚴(yán)重阻礙了該病毒引起疾病的預(yù)防工作，因此該病毒檢測試劑盒的開發(fā)和檢測技術(shù)的研究顯得尤為重要。

RT-LAMP是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)針對靶基因的6個區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異引物，利用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和DNA聚合酶同時作用，使得病毒cDNA合成和核酸擴(kuò)增同時進(jìn)行，并且DNA聚合酶是一種鏈置換DNA聚合酶(Bst?DNA?polymerase)在恒溫條件下即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶。RT-LAMP技術(shù)在保持PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性并縮短了檢測時間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，在等溫條件下就能使反轉(zhuǎn)錄和核酸擴(kuò)增同時完成反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現(xiàn)場快速檢測。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計(jì)提供羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP檢測試劑盒和檢測方法的技術(shù)方案，該試劑盒特異性強(qiáng)，敏感性高，該方法方便、靈敏、準(zhǔn)確、快速，為羅氏沼蝦幼體綜合癥的預(yù)防奠定基礎(chǔ)。

所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包括RNA提取試劑和RT-LAMP反應(yīng)試劑，

所述的RNA提取試劑含有Trizol試劑、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水；

所述的RT-LAMP反應(yīng)試劑含有:

1）RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液：20～25mM?pH為8.2～9.0的Tris-HC1、6～10mM硫酸鎂、10～12mM氯化鉀、8～12mM硫酸銨、0.l～0.2%?Triton?X-100或Tween?20、1～1.6?mM?dNTP、0.6～1.0?M甜菜堿、1.5～2.2μM引物MRDV-FIP、1.5～2.2μM引物MRDV-BIP、0.15～0.3μM引物MRDV-F3、0.15～0.3μM引物MRDV-B3，?

引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ?No.1所示，

引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ?No.2所示，

引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ?No.3所示，

引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ?No.4所示；

2）逆轉(zhuǎn)錄酶：每微升含10個活性單位的AMV逆轉(zhuǎn)錄酶；

3）聚合酶：每微升含8個活性單位的Bst?DNA聚合酶；

4）RT-LAMP反應(yīng)穩(wěn)定液：由礦物油或液體石蠟油組成；

5）RT-LAMP反應(yīng)顯色液：含有10?%?SYBR?Green?I的熒光染料。

所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液含有21～24mM?pH為8.2～9.0的Tris-HC1、7～9mM硫酸鎂、11～12mM氯化鉀、9～11mM硫酸銨、0.l～0.2%?Triton?X-100或Tween?20、1.2～1.4?mM?dNTP、0.7～0.9?M甜菜堿、1.6～2.0μM引物MRDV-FIP、1.6～2.0μM引物MRDV-BIP、0.2～0.25μM引物MRDV-F3、0.2～0.25μM引物MRDV-B3。

所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預(yù)反應(yīng)液中還含有0.6～1.2μM引物MRDV-LB和0.6～1.2μM引物MRDV-LF，

引物MRDV?-LF核苷酸序列如SEQ?No.5所示，

引物MRDV?-LB核苷酸序列如SEQ?No.6所示。