[發明專利]羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201110239776.5
• 申請日: 2011-08-19
• 公開（公告）號: CN102277453A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 潘曉藝;沈錦玉;郝貴杰;姚嘉赟;徐洋;尹文林;曹錚
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所 33213
• 代理人: 吳秉中

1.羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于包括RNA提取試劑和RT-LAMP反應試劑，

所述的RNA提取試劑含有Trizol、氯仿、異丙醇、無RNase的70%乙醇和DEPC水；

所述的RT-LAMP反應試劑含有:

1）RT-LAMP預反應液：20～25mM?pH為8.2～9.0的Tris-HC1、6～10mM硫酸鎂、10～12mM氯化鉀、8～12mM硫酸銨、0.l～0.2%?Triton?X-100或Tween?20、1～1.6?mM?dNTP、0.6～1.0?M甜菜堿、1.5～2.2?μM引物MRDV-FIP、1.5～2.2μM引物MRDV-BIP、0.15～0.3μM引物MRDV-F3、0.15～0.3μM引物MRDV-B3，?

引物MRDV-FIP核苷酸序列如SEQ?No.1所示，

引物MRDV-BIP核苷酸序列如SEQ?No.2所示，

引物MRDV-F3核苷酸序列如SEQ?No.3所示，

引物MRDV-B3核苷酸序列如SEQ?No.4所示；

2）逆轉錄酶：每微升含10個活性單位的AMV逆轉錄酶；

3）聚合酶：每微升含8個活性單位的Bst?DNA聚合酶；

4）RT-LAMP反應穩定液：由礦物油或液體石蠟油組成；

5）RT-LAMP反應顯色液：含有10?%?SYBR?Green?I的熒光染料。

2.如權利要求1所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預反應液含有21～24mM?pH為8.2～9.0的Tris-HC1、7～9mM硫酸鎂、11～12mM氯化鉀、9～11mM硫酸銨、0.l～0.2%?Triton?X-100或Tween?20、1.2～1.4?mM?dNTP、0.7～0.9?M甜菜堿、1.6～2.0μM引物MRDV-FIP、1.6～2.0?μM引物MRDV-BIP、0.2～0.25?μM引物MRDV-F3、0.2～0.25?μM引物MRDV-B3。

3.如權利要求1所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預反應液中還含有0.6～1.2?μM引物MRDV-LB和0.6～1.2?μM引物MRDV-LF，

引物MRDV?-LF核苷酸序列如SEQ?No.5所示，

引物MRDV?-LB核苷酸序列如SEQ?No.6所示。

4.如權利要求1或2或3所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于檢測試劑盒還具有陽性對照試樣和陰性對照試樣，所述陽性對照試樣為羅氏沼蝦雙順反子病毒基因組RNA，所述的陰性對照試樣為無核酸去離子水。

5.如權利要求3所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測試劑盒，其特征在于所述的RT-LAMP預反應液中還含有0.8～1.0μM引物MRDV-LB和0.8～1.2μM引物MRDV-LF。

6.羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

1）羅氏沼蝦RNA抽提：利用RNA提取試劑抽提羅氏沼蝦RNA；

2）羅氏沼蝦雙順反子病毒的RT-LAMP擴增：

a）根據待檢測樣品的數目，設置所需RT-LAMP反應管數N，N=樣品數+2，其中l管為陽性對照，l管為陰性對照；

b）吸取RT-LAMP預反應液的體積為N×22.5μL，加入1.5mL離心管中，然后加入NμL?Bst?DNA聚合酶和N/2?μL?AMV逆轉錄酶，混合均勻，1500～2000轉/分鐘離心10秒，取上清的混合液；

c）向上述設定的N個反應管中分別加入24uL步驟b）所得的混合液，并向N個反應管內按順序依次分別加入陰性對照、待檢模板RNA和陽性對照RNA各lμL；

d）在每個反應管中再分別加入30?u?L?RT-LAMP反應穩定液，蓋緊管蓋并做好標記，2000轉/分鐘離心5秒；

e）.在61℃～67℃下恒溫反應40～70分鐘；

3）顯色檢測：

取出RT-LAMP反應管，冷卻至室溫，2000轉/分鐘離心5秒，按照陰性對照、待檢樣品和陽性對照的順序依次分別加入lμL?RT-LAMP反應顯色液，輕輕混勻，直接用肉眼觀察顏色變化。

7.如權利要求6所述的羅氏沼蝦雙順反子病毒的LAMP檢測方法，其特征在于所述的步驟1）羅氏沼蝦RNA提取包括以下步驟：取羅氏沼蝦幼體頭胸部或是成蝦鰓組織0.1～0.2g，于冰上用研磨棒研磨，加300μL?Trizol后，繼續研磨充分后加Trizol至1mL，旋渦震蕩1分鐘，室溫5分鐘，加入200μL氯仿，旋渦震蕩30秒，室溫靜置3分鐘，12000g離心10分鐘；取上層水相于新的EP管中，加入500μL異丙醇，室溫放置10分鐘后，12000g離心10min；移去上清，沉淀用70％乙醇洗滌2次，室溫干燥5～10min后以DEPC處理的去離子水重懸，得到待測羅氏沼蝦RNA。