[發(fā)明專(zhuān)利]同時(shí)提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率及晶體質(zhì)量的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110237497.5
• 申請(qǐng)日: 2011-08-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102286067A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-12-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 尹大川;郭云珠;曹慧玲;張辰艷;馬曉亮;崔超
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 西北工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C07K1/14
• 分類(lèi)號(hào): C07K1/14
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• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率的方法，具體是一種同時(shí)提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率及晶體質(zhì)量的方法。

背景技術(shù)

開(kāi)展蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究，首先要獲得蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)信息。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法中，X射線單晶衍射技術(shù)作為最成熟、分辨率最高的解析方法，承擔(dān)了超過(guò)87％的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析任務(wù)。實(shí)施該技術(shù)，需要高質(zhì)量的蛋白質(zhì)晶體作為衍射樣品。但由于獲取高質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體普遍存在較大的難度，因此，蛋白質(zhì)結(jié)晶是X射線單晶衍射技術(shù)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的瓶頸環(huán)節(jié)之一。

文獻(xiàn)：Thakur等在蛋白質(zhì)結(jié)晶條件篩選中添加9種特定的粉末(氣相二氧化硅、交聯(lián)葡萄糖、沙子、二氧化鈦、玻璃絲、羥基磷灰石、纖維素、馬毛以及干海藻)以及它們的混合物作為異相形核劑誘導(dǎo)10種蛋白質(zhì)結(jié)晶(Nucleation?and?growth?of?lysozyme?crystals?under?external?electric?field[J].Colloids?and?Surfaces?A：Physicochemical?and?Engineering?Aspects，2002，209(2-3)：139-145)。實(shí)驗(yàn)選用Crystal?Screen?HT篩選試劑盒，以0.5μg形核劑：1μL蛋白質(zhì)溶液的比例將形核劑與蛋白質(zhì)溶液混合，結(jié)晶液滴為100nL蛋白質(zhì)溶液與100nL結(jié)晶劑溶液的混合液滴。選用氣相二氧化硅、交聯(lián)葡萄糖、沙子作為形核劑的蛋白質(zhì)結(jié)晶的成功率降低至-30％，-20％，-2％。其余幾種形核劑提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率在2％-67％之間。

這些方法均是利用異相形核的方法，存在如下的缺點(diǎn)：(1)在一定程度上提高了蛋白質(zhì)晶體的成功率，但是由于異相形核僅是提供了一個(gè)形核位點(diǎn)，并沒(méi)有局部提高蛋白質(zhì)晶體的濃度，因此提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率效果不顯著。(2)由于異相形核劑與蛋白質(zhì)晶體粘附在一起，導(dǎo)致晶體晶面缺失，不利于提高蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量。(3)這些異相形核劑，雖然能誘導(dǎo)部分蛋白質(zhì)晶體形核，但卻會(huì)成為另外一些蛋白質(zhì)形核的抑制劑。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決現(xiàn)有的蛋白質(zhì)結(jié)晶方法難以同時(shí)提高結(jié)晶成功率和晶體質(zhì)量的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種同時(shí)提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率及晶體質(zhì)量的方法。該方法利用對(duì)蛋白質(zhì)具有吸附一解吸附功能的吸附材料，在結(jié)晶溶液中同時(shí)形成兩個(gè)濃度區(qū)域，在吸附材料附近的高濃度區(qū)，及遠(yuǎn)離吸附材料的低濃度區(qū)。從而同時(shí)達(dá)到高濃度條件促使蛋白形核，低濃度條件促使蛋白晶體生長(zhǎng)。將吸附材料置于溶液內(nèi)的上方位置，晶體在上方形核，起到提高結(jié)晶成功率的作用。而當(dāng)晶體長(zhǎng)大到數(shù)微米尺度時(shí)，因重力作用，沉降到溶液內(nèi)下方位置，該位置溶液濃度低，又可以起到提高晶體質(zhì)量的作用。此外，由于晶體生長(zhǎng)消耗溶質(zhì)，其周邊濃度降低，此時(shí)，吸附的蛋白質(zhì)又會(huì)被解吸附，補(bǔ)充到溶液中，使晶體生長(zhǎng)過(guò)程中，其周邊溶液濃度變化更平緩，也有利于高質(zhì)量晶體的生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明既可以提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率，又可以提高蛋白質(zhì)結(jié)晶質(zhì)量。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種同時(shí)提高蛋白質(zhì)結(jié)晶成功率及晶體質(zhì)量的方法，其特點(diǎn)是包括下述步驟：

(a)將濃度為10-80mg/mL、體積為2-20μL或者1-6顆吸附-解吸附材料添加到蛋白質(zhì)結(jié)晶容器中擬結(jié)晶位置；對(duì)于密度大于蛋白質(zhì)溶液的吸附-解吸附材料的添加方法是在結(jié)晶孔板中擬結(jié)晶位置涂抹真空脂，用小鑷子將吸附-解吸附材料粘附在涂有真空酯的結(jié)晶孔板中擬結(jié)晶位置上；對(duì)于密度小于蛋白質(zhì)溶液的-解吸附吸附材料的添加方法是將吸附-解吸附材料直接添加到結(jié)晶孔板中擬結(jié)晶位置；或者將吸附-解吸附材料用酒精分散成溶液，用移液器添加至結(jié)晶孔板中擬結(jié)晶位置；

(b)將擬結(jié)晶的蛋白質(zhì)加入到緩沖液中，溶解，制成濃度＞0mg/mL，并且蛋白質(zhì)溶液的初始濃度是6～50mg/mL；

(c)將蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑與蛋白質(zhì)溶液按照體積比為1∶0.1～4混合，配制出蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液；

(d)將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液添加到蛋白質(zhì)結(jié)晶容器中擬結(jié)晶位置，與蛋白質(zhì)結(jié)晶容器中吸附-解吸附材料混合；

(e)將蛋白質(zhì)結(jié)晶溶液與蛋白質(zhì)結(jié)晶試劑置于同一密封空間但不互相接觸，形成一個(gè)穩(wěn)定的氣相擴(kuò)散體系，在恒溫4～22℃溫度范圍內(nèi)靜置4～30天，實(shí)現(xiàn)結(jié)晶。

所述吸附-解吸附材料是無(wú)機(jī)納米材料、聚合物纖維或者聚合物吸附樹(shù)脂的任一種。

所述無(wú)機(jī)納米材料包括粘土礦和活性氧化鋁。

所述聚合物纖維是聚丙烯晴碳纖維。