技術領域
本發明涉及一種制備飼養層細胞的方法。
背景技術
飼養層細胞是用特定的細胞(如皮膚成纖維細胞、輸卵管上皮細胞等)經射線照射或絲裂霉素-C等阻斷有絲分裂處理后制備的單層細胞，飼養層細胞能分泌成纖維細胞生長因子、胰島素樣生長因子等促有絲分裂因子，促進胚胎干細胞(Embryonic?stem?cell，ES細胞)的增殖，同時也能分泌白血病抑制因子(Leukemia?inhibitory{actor，LIF)等細胞分化抑制因子，抑制ES細胞的分化。
ES細胞是從胚胎內細胞團或原始生殖嵴中分離，經體外抑制分化培養獲得的一種高度未分化的具有多發育潛能性的細胞系。ES細胞對體外培養條件要求極為嚴格，飼養層的質量好壞直接關系到ES細胞的分離成功與否。小鼠胚胎成纖維細胞作為飼養層能有效促進胚胎干細胞及誘導多能性干細胞增殖并維持其未分化特性和多潛能性，故而常用于ES細胞的體外分離培養，是各實驗室開展干細胞研究的前提，是干細胞研究不可缺少的環節。目前小鼠胚胎成纖維細胞fmouse?embryonic?fibroblast，MEF)制備飼養層主要使用的方法有γ射線照射或者使用絲裂霉素C處理。γ射線的優點是可大批處理MEF細胞，但是一些小的實驗室不具備實驗條件。因此多數實驗研究均采用絲裂霉素C處理MEF來制備飼養層。但是，目前分離培養飼養層細胞的方法大多數屬于經驗性，制備過程繁瑣，工作量大，細胞處理的方法、條件尚無確切的規程和報道。
發明內容
本發明的目的是提供一種制備飼養層細胞的方法。
本發明提供的制備飼養層細胞的方法，包括如下步驟：
(1)將離體的成纖維細胞用10μg/ml絲裂霉素C處理，分別收集培養液上清和貼壁細胞；
(2)將離體的成纖維細胞用前一步驟收集的培養液上清處理，收集貼壁細胞；
在所述步驟(1)和所述步驟(2)之間還包括0至2次的如下步驟：將離體的成纖維細胞用前一步驟收集的培養液上清處理，分別收集培養液上清和貼壁細胞；
以上每一步驟得到的貼壁細胞均為飼養層細胞。
所述步驟(1)中，所述成纖維細胞(離體的)具體可在含10μg/ml絲裂霉素C的完全培養基中進行所述處理。所述完全培養基可為任何市售的用于細胞培養的完全培養基，具體可由DMEM培養基和如下溶質組成：10％(體積比)FBS，2mmol/Lglutamine。
所述步驟(1)，和/或所述步驟(2)，和/或所述步驟(1)和所述步驟(2)之間的步驟中，所述處理的條件具體可為37℃、5％CO2培養箱中培養2.5h。
在進行所述方法前，所述成纖維細胞可先進行傳代；用傳代后的成纖維細胞(離體的)進行所述步驟(1)，和/或所述步驟(2)，和/或所述步驟(1)和所述步驟(2)之間的步驟。
所述傳代的方法具體如下：將所述成纖維細胞(離體的)進行消化后培育2-4天(如2-3天)，然后進行(1∶3)-(1∶5)傳代。所述傳代的次數具體可為2-5次(如3-5次)，優選為3次。
所述成纖維細胞(離體的)進行所述消化后培育2-4天后達到的細胞密度具體可為80-90％。
所述方法還可包括將所述貼壁細胞進行消化的步驟。
所述方法優選包括如下步驟：將每一步驟得到的所述貼壁細胞消化后立即于4℃放置30分鐘，然后置于-80℃。進行所述4℃放置之前，所述貼壁細胞具體可用完全培養基重懸并與4℃預冷的2×凍存液等體積混合。所述完全培養基具體可由DMEM培養基和如下溶質組成：10％(體積比)FBS，2mmol/L?glutamine。所述2×凍存液具體可由DMEM培養基和如下溶質組成：10％(體積比)DMSO，10％(體積比)FBS，2mmol/Lglutamine。
所述成纖維細胞(離體的)具體可為小鼠胚胎成纖維細胞(離體的)。所述飼養層細胞具體可為用于培養胚胎干細胞的飼養層細胞
以上任一所述方法得到的飼養層細胞也屬于本發明的保護范圍。
所述飼養層細胞可用于培養胚胎干細胞，如人胚胎干細胞。
本發明提供一種較為簡捷易掌握的飼養層制備方法，為培養ESC、iPS細胞并開展相關研究奠定了基礎。利用該方法制備成纖維細胞飼養層，既簡化了實驗操作，又節省了實驗費用。
