[發(fā)明專(zhuān)利]快速篩選高效降解農(nóng)藥毒死蜱殘留菌株的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110236947.9
• 申請(qǐng)日: 2011-08-18
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102311933A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐欣昀;花日茂;王道勝;張君;高婷婷
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 合肥金安專(zhuān)利事務(wù)所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于環(huán)境生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及采用直觀的水解透明圈作為初篩指標(biāo)，快速篩選降解環(huán)境中農(nóng)藥毒死蜱殘留的高效降解菌株。

背景技術(shù)

我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥的生產(chǎn)量和使用量均呈逐年遞加之勢(shì)。農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的大量應(yīng)用，對(duì)于防治農(nóng)作物病蟲(chóng)害方面起到了極其重要的作用，為糧食豐收提供了可靠的保證。但是長(zhǎng)期大量地使用農(nóng)藥使得環(huán)境中的農(nóng)藥污染日益嚴(yán)重，危及人們身體健康、食品安全及其他環(huán)境問(wèn)題。有機(jī)磷類(lèi)農(nóng)藥得到長(zhǎng)期、廣泛、大量的應(yīng)用，其中農(nóng)藥毒死蜱是世界上使用量最大的農(nóng)藥之一。在我國(guó)，農(nóng)藥毒死蜱是甲胺磷和甲基對(duì)硫磷等高毒農(nóng)藥的新型高效、低毒替代品種，生產(chǎn)量和使用量很大。雖然農(nóng)藥毒死蜱是低毒的農(nóng)藥，但是使用量之大、使用范圍之廣，已對(duì)我國(guó)大部分地區(qū)的土壤、水體造成了嚴(yán)重的污染。存儲(chǔ)在土壤、水體中的農(nóng)藥毒死蜱殘留不僅對(duì)動(dòng)植物、微生物等生命體產(chǎn)生毒害作用，而且，還直接和間接地影響了人類(lèi)的健康，所以，需要研發(fā)高效清除農(nóng)藥毒死蜱等有機(jī)磷殘留污染的生態(tài)修復(fù)技術(shù)，為農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)和環(huán)境安全提供技術(shù)支持和材料。

本領(lǐng)域主要存在以下問(wèn)題。①、已報(bào)道的農(nóng)藥毒死蜱降解菌株的降解能力比較低，大部分菌株只能降解10mg/L～80mg/L的農(nóng)藥毒死蜱；已報(bào)道的菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的速度很慢，一般需要10天～30天以上的時(shí)間才可以降解80%以上的農(nóng)藥毒死蜱。②、在一般研究中采用普通富集培養(yǎng)基進(jìn)行富集培養(yǎng)，在富集過(guò)程中保持培養(yǎng)基的濃度不變，培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度較低，不能真實(shí)模擬自然環(huán)境條件；在富集過(guò)程中添加的農(nóng)藥毒死蜱的濃度也較低，一般只有50mg/L～100mg/L；富集的時(shí)間也較長(zhǎng)，可達(dá)60天以上；這些情況導(dǎo)致富集效率低，可能漏篩高效菌株。③、在一般微生物學(xué)研究中都是采用添加高濃度底物的方式制備選擇性培養(yǎng)基，采用稀釋平板法篩選降解各類(lèi)化合物的降解菌株，以平板上出現(xiàn)的水解圈（降解圈）的大小作為指標(biāo)來(lái)判斷菌株的降解能力；但農(nóng)藥毒死蜱在水中的溶解度很低，只有1mg/L；研究人員一般在選擇性培養(yǎng)基平板上只添加10mg/L～100mg/L的農(nóng)藥毒死蜱，農(nóng)藥毒死蜱的含量很低，即使目標(biāo)菌株能夠降解毒死蜱，也無(wú)法在平板上形成水解圈，研究人員無(wú)法依據(jù)可靠的指標(biāo)來(lái)挑選目的菌株，只能隨機(jī)大量挑取平板上長(zhǎng)出的菌株，然后測(cè)定這些菌株的降解能力。因此普通的篩選方法具有很大的盲目性，工作效率很低。

發(fā)明內(nèi)容

現(xiàn)有篩選農(nóng)藥毒死蜱降解菌株的方法具有很大的盲目性，工作效率很低，為解決存在的這一問(wèn)題，本發(fā)明提供一種快速篩選高效降解農(nóng)藥毒死蜱殘留的菌株的方法，為農(nóng)藥污染生物修復(fù)提供可靠的菌株材料。

具體技術(shù)解決方案如下：

快速篩選高效降解農(nóng)藥毒死蜱殘留的菌株的方法，其操作步驟如下：

1、以農(nóng)藥毒死蜱為碳源富集高效降解菌株

取50mL富集培養(yǎng)基，加入含有農(nóng)藥毒死蜱480g/L的農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑5.2μL，使富集培養(yǎng)基中的農(nóng)藥毒死蜱凈含量為50mg/L，再加入含有農(nóng)藥毒死蜱殘留5mg～10mg的污泥5g；溫度30℃、轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分鐘條件下，搖床培養(yǎng)21天～35天；每7天加入含有農(nóng)藥毒死蜱480g/L的農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑5.2μL和12.5mL富集培養(yǎng)基，得到降解農(nóng)藥毒死蜱菌株的富集培養(yǎng)物；

富集培養(yǎng)基配方：硫酸鎂0.1g/L、磷酸氫二鉀1.0g/L、磷酸二氫鉀0.3g/L、蛋白胨1.0g/L、水1L，pH調(diào)至7.0~7.2，121℃滅菌20分鐘；

2、以含農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑的選擇培養(yǎng)基篩選高效降解菌株

2.1、高效降解菌株選擇性培養(yǎng)基的制備

在1L富集培養(yǎng)基中加入瓊脂粉12g，溫度121℃滅菌20分鐘；冷卻至50℃時(shí)，取20mL加入瓊脂粉的富集培養(yǎng)基至平板，在平板中加入含有農(nóng)藥毒死蜱480g/L的農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑4.2μL～12.6μL，使平板培養(yǎng)基中農(nóng)藥毒死蜱的含量為100?mg/L～300?mg/L，制得選擇性培養(yǎng)基平板；

2.2、初篩過(guò)程