[發(fā)明專利]快速篩選高效降解農(nóng)藥毒死蜱殘留菌株的方法

無效

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• 申請日: 2011-08-18
• 公開（公告）號: CN102311933A
• 公開（公告）日: 2012-01-11
• 發(fā)明（設計）人: 唐欣昀;花日茂;王道勝;張君;高婷婷
• 申請（專利權）人: 安徽農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

1.?快速篩選高效降解農(nóng)藥毒死蜱殘留菌株的方法，其特征在于：

1.1、以農(nóng)藥毒死蜱為碳源富集高效降解菌株

取50mL富集培養(yǎng)基，加入含有農(nóng)藥毒死蜱480g/L的農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑5.2μL，使富集培養(yǎng)基中的農(nóng)藥毒死蜱凈含量為50mg/L，再加入含有農(nóng)藥毒死蜱殘留5mg～10mg的污泥5g；溫度30℃、轉速120轉/分鐘條件下，搖床培養(yǎng)21天～35天；每7天加入含有農(nóng)藥毒死蜱480g/L的農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑5.2μL和12.5mL富集培養(yǎng)基，得到降解農(nóng)藥毒死蜱菌株的富集培養(yǎng)物；

1.2、以含農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑的選擇培養(yǎng)基篩選高效降解菌株

1.2.1、高效降解菌株選擇性培養(yǎng)基的制備

在1L富集培養(yǎng)基中加入瓊脂粉12g，溫度121℃滅菌20分鐘；冷卻至50℃時，取20mL加入瓊脂粉的富集培養(yǎng)基至平板，在平板中加入含有農(nóng)藥毒死蜱480g/L的農(nóng)藥毒死蜱乳油制劑4.2μL～12.6μL，使平板培養(yǎng)基中農(nóng)藥毒死蜱的含量為100?mg/L～300?mg/L，制得選擇性培養(yǎng)基平板；

1.2.2、初篩過程

采用十倍稀釋法稀釋降解農(nóng)藥毒死蜱菌株的富集培養(yǎng)物，得到八種濃度的稀釋液，八種稀釋液的稀釋度分別為：10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8；取八種稀釋度的稀釋液各100?μL，分別涂在選擇性培養(yǎng)基平板上，溫度30℃～37℃，倒置培養(yǎng)2~3天；挑選選擇性培養(yǎng)基平板上周圍出現(xiàn)透明水解圈的菌落，在牛肉膏蛋白胨平板上劃線純化，然后接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上，得到20株以上的降解農(nóng)藥毒死蜱的初篩菌株；

1.3、復篩降解農(nóng)藥毒死蜱的高效降解菌株

對得到20株以上的降解農(nóng)藥毒死蜱的初篩菌株按照下列步驟分別進行操作：

1.3.1、制備菌液

從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基斜面上挑取一環(huán)降解農(nóng)藥毒死蜱的初篩菌株接種于盛有30mL牛肉膏蛋白胨的液體培養(yǎng)基中，在溫度30℃、轉速120轉/分鐘條件下，搖床培養(yǎng)24小時，即制得初篩菌株菌液；

1.3.2、測定初篩菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的降解率

農(nóng)藥毒死蜱石油醚溶液的制備：取農(nóng)藥毒死蜱含量95%的農(nóng)藥毒死蜱，用石油醚稀釋，得到農(nóng)藥毒死蜱含量為5?mg/mL的農(nóng)藥毒死蜱石油醚溶液；

取20mL的比色管2支；每支比色管內(nèi)加入濃度5mg/mL的農(nóng)藥毒死蜱石油醚溶液0.1mL～0.2mL，用氮吹儀吹干，向每只比色管中加入所述富集培養(yǎng)基4.5?mL；在第1支比色管中加入初篩菌株菌液0.5mL，在第2支比色管加入富集培養(yǎng)基0.5mL；第2支比色管為對照組；將2支比色管均在溫度30℃、轉速120轉/分鐘條件下，搖床避光培養(yǎng)24小時，制得初篩菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的樣品和對照組樣品；

1.3.3、用石油醚萃取殘留的農(nóng)藥毒死蜱

向初篩菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的樣品和對照組樣品中分別加入石油醚5mL，渦旋振蕩2分鐘，靜置5分鐘；待初篩菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的樣品和石油醚分層，用膠頭滴管吸取上層石油醚，經(jīng)無水硫酸鈉過濾至10mL容量瓶中，用石油醚將濾液定容至10?mL，制得降解后農(nóng)藥毒死蜱殘留樣品；待對照組樣品和石油醚分層，用膠頭滴管吸取上層石油醚，經(jīng)無水硫酸鈉過濾至10mL容量瓶中，用石油醚將濾液定容至10?mL，制得對照組殘留樣品；

1.3.4、檢測

采用氣相色譜法測定降解后農(nóng)藥毒死蜱殘留樣品和對照組殘留樣品中農(nóng)藥毒死蜱的含量，以復篩高效菌株；

氣相色譜工作條件：用氮氣作載氣，流速：27?mL·min^-1，柱流量4.00?mL·min^-1；進樣口SPL，分流比1：5，進樣體積1?μL；色譜柱：Agilent?DB-5毛細色譜柱，內(nèi)徑0.23?mm、長度30?m、膜厚0.25?μm；使用ECD檢測器；進樣口、色譜柱、檢測器的溫度分別為240?℃、210?℃、280?℃；

計算初篩菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的降解率R：

式中，R為初篩菌株降解農(nóng)藥毒死蜱的降解率；C為降解后農(nóng)藥毒死蜱殘留樣品中的農(nóng)藥毒死蜱的殘留量；C_ck為對照組殘留樣品的農(nóng)藥毒死蜱殘留量；

得到20個以上的降解農(nóng)藥毒死蜱的初篩菌株對農(nóng)藥毒死蜱的降解率，比較20株以上的降解農(nóng)藥毒死蜱的初篩菌株對農(nóng)藥毒死蜱的降解率，降解率大于60%的初篩菌株即為篩選出的降解農(nóng)藥毒死蜱殘留的高效降解菌株；

經(jīng)以上方法獲得兩株降解農(nóng)藥毒死蜱殘留的高效降解菌株，即X1菌株和G1菌株，經(jīng)鑒定X1菌株為臺灣嗜銅菌Cupriavidus?taiwanensis，G1菌株為微嗜酸寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas?acidaminiphila。