[發明專利]小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒及制備方法

有效

• 申請號: 201110236942.6
• 申請日: 2011-08-18
• 公開（公告）號: CN102419369A
• 公開（公告）日: 2012-04-18
• 發明（設計）人: 楊建民;艾軍;葉玲玲;楊俊興;祝賀;孫潔;周曉黎;花群義;董俊;徐維加;徐自忠;尹尚蓮;呂建強
• 申請（專利權）人: 云南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N33/535
• 代理公司: 云南派特律師事務所 53110
• 代理人: 張怡;岳亞蘇

1.一種小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于主要包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原和小反芻獸疫單克隆抗體；所述的小反芻獸疫核蛋白抗原是由昆蟲細胞表達的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI登錄號為：X74443.2，表達蛋白分子量約61.3?kDa，由1578bp?核酸組成，編碼526個氨基酸；所述的小反芻獸疫單克隆抗體是針對小反芻獸疫Nigeria75/1株核蛋白的特異性單克隆抗體，抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈分子量約55ku和26ku，染色體數目約99-104條，相對親和力指數為1.0?mol/L。

2.一種小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于包括分別放置的小反芻獸疫核蛋白抗原、小反芻獸疫單克隆抗體、稀釋液、強陽性血清、弱陽性血清、陰性血清、HRP羊抗鼠二抗、20倍濃縮洗滌液、底物液、終止液和酶鏈免疫吸附板；所述的小反芻獸疫核蛋白抗原是由昆蟲細胞表達的小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗株核蛋白，核蛋白基因序列NCBI登錄號為：X74443.2，表達蛋白分子量約61.3?kDa，由1578bp?核酸組成，編碼526個氨基酸；所述的小反芻獸疫單克隆抗體是針對小反芻獸疫Nigeria75/1株核蛋白的特異性單克隆抗體，抗體免疫球蛋白重鏈和輕鏈分子量約55ku和26ku，染色體數目約99-104條，相對親和力指數為1.0?mol/；所述的稀釋液配方為：NaCl?8g，KH₂PO_4??0.24g，Na₂HPO₄??1.44g，KCl??0.2g，牛血清白蛋白BSA?30?g，山羊PPRV陰性、Vero細胞抗體陽性血清10?mL，加蒸餾水至1000mL。

3.如權利要求2所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒，其特征在于所述的檢測試劑盒各組成部分的體積或數量如下：

試劑盒主要組成部分名稱：體積或數量：小反芻獸疫核蛋白抗原?15mL小反芻獸疫單克隆抗體0.1 mL稀釋液15 mL強陽性血清0.2 mL弱陽性血清0.2 mL陰性血清0.2 mLHRP羊抗鼠二抗0.15mL20倍濃縮洗滌液25mL底物液15 mL終止液15 mL? 酶聯免疫吸附板1塊

。

4.權利要求1所述的小反芻獸疫病毒b-ELISA抗體檢測試劑盒的制備方法由以下步驟制備：

一、小反芻獸疫核蛋白抗原的制備：

利用昆蟲桿狀病毒表達載體pFastBacHTA表達小反芻獸疫疫苗株Nigeria75/1的N基因，在獲得表達的桿狀病毒后，大量感染sf9細胞，反復凍融，8000rpm離心，取上清，35000rpm離心，按離心前后體積300：1，用PBS溶解沉淀蛋白，用0.05mol/L??PH為9.6碳酸鹽緩沖液NaHCO₃?1.465g、Na₂CO₃?0.795g或Na₂CO₃.10H₂O?1.2g、水500mL稀釋成2.9μg/mL，分裝即得；

二、小反芻獸疫單克隆抗體的制備：

使用純化的小反芻獸疫病毒免疫小鼠并取免疫小鼠的脾細胞，將所述脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞在融合劑下融合后篩選獲得雜交瘤細胞，收集雜交瘤細胞上清液制備抗小反芻獸疫單克隆抗體。