[發明專利]以MyD88TIR二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型及應用

無效

• 申請號: 201110236314.8
• 申請日: 2011-08-17
• 公開（公告）號: CN102321586A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 巴雪青;曾憲錄
• 申請（專利權）人: 東北師范大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/79;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 王薇

1.以MyD88TIR二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型，其特征在于：可以將MyD88分子的TIR結構域(以下稱MyD88?TIR)分別與一熒光供體和熒光受體蛋白基因GFP/RFP(或CFP/YFP)構建融合蛋白質粒，轉染哺乳動物細胞，建立雙陽性表達的細胞株。如兩種生物大分子(熒光供體分子和熒光受體分子)的距離足夠近，即小于10nm，為兩蛋白分子直接相互作用的距離，在熒光供體的激發光照射下可以產生熒光受體的發射光信號，即發生熒光共振能量轉移(FRET)；如果熒光供體分子和熒光受體分子的結合受到阻礙，則FRET受到影響。

其具體步驟如下：首先構建綠色熒光蛋白與MyD88TIR的融合蛋白真核表達質粒(以下簡稱GFP-MyD88?TIR)和紅色熒光蛋白與MyD88?TIR的融合蛋白真核表達質粒(以下簡稱RFP-MyD88?TIR)；再將二者共同轉染哺乳動物細胞(如HeLa)，并建立雙陽性表達的細胞株。如果培養條件中不存在小分子抑制物，MyD88?TIR發生二聚化，488nm激發光(藍光)照射下GFP-MyD88?TIR發出的綠色熒光會有一部分作為RFP-MyD88?TIR的激發光被吸收，進而發出紅色熒光，綠熒光減弱，即FRET發生；而如果培養條件中有小分子抑制物存在的話，MyD88?TIR無法發生二聚化，488nm激發光(藍光)照射下GFP-MyD88?TIR發出的綠色熒光不會轉移給RFP-MyD88?TIR，無紅色熒光發出，產生正常的綠色熒光。細胞培養和藥物篩選可結合高通量篩選儀及熒光值的相關函數運算；

對于上述基于熒光信號變化的篩選模型認定陽性(即，對FRET有影響)的化合物，還需利用原核表達并純化的重組蛋白，進行體外蛋白質-蛋白質相互作用的驗證分析：當培養細胞中FRET現象被某種添加的化合物阻斷了，尚不能得出是這種化合物直接阻斷了MyD88?TIR的二聚化結論，還是這種化合物引發了某種細胞內信號級聯，間接地影響了MyD88?TIR的二聚化；因此利用一個His-MyD88TIR和GST-MyD88?TIR重組蛋白體外相互作用分析加以驗證；

具體步驟如下：在非變性緩沖液中，可以加入上述熒光篩選模型認為有效阻斷MyD88?TIR二聚化的化合物，如果化合物能直接阻斷MyD88?TIR的二聚化，則His-MyD88?TIR體外條件下不能正常結合GST-MyD88?TIR，進行His-MyD88?TIR結合物(Pull-down產物)的western?blot分析，不能檢測到GST抗體識別的信號；如果化合物不能直接阻斷MyD88?TIR二聚化，His-MyD88?TIR體外條件下能夠正常結合GST-MyD88?TIR，進行His-MyD88?TIR結合物(Pull-down產物)的western?blot分析，則可以檢測到GST抗體識別的信號；經此驗證模型，確切的MyD88?TIR二聚化抑制劑就可得以判定。

2.以MyD88?TIR二聚化為靶點的抗炎抑制劑篩選模型用于對商品化的小分子庫、自行制備的天然產物組分或各種化學合成物、修飾物進行廣泛的篩選，從中獲得有效的MyD88二聚化的抑制性化合物，參與對MyD88信號通路依賴的慢性炎癥、自身免疫性疾病的藥物篩選。