[發(fā)明專利]鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA方法檢測試劑盒及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110235293.8
• 申請日: 2011-08-17
• 公開（公告）號: CN102323428A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張蓉蓉;羅青平;溫國元;邵華斌;艾地云;王紅琳;楊峻;羅玲;楊依霏
• 申請（專利權(quán)）人: 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

1.一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：a)抗體檢測板，b)酶結(jié)合物工作液，c)陽性對照，d)陰性對照，e)樣品稀釋液，f)10×濃縮洗滌液，g)底物顯色液A，h)底物顯色液B和i)終止液，其中：所述的抗體檢測板為包被鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的可拆96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板，酶結(jié)合物工作液為辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鴨IgY多克隆抗體，陽性對照為鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株免疫雛鴨制備高免血清，陰性對照為經(jīng)篩選獲得的未免疫鴨疫里默氏桿菌的雛鴨的陰性血清。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述的鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的制備方法為：利用PCR技術(shù)擴(kuò)增鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重組技術(shù)構(gòu)建鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的原核表達(dá)質(zhì)粒，命名為pET-28a-OmpA；將質(zhì)粒pET-28a-OmpA轉(zhuǎn)入宿主菌大腸桿菌中成為基因工程菌，命名為BLpET-28a-OmpA，將BLpET-28a-OmpA在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)并經(jīng)SDS-PAGE電泳分析顯示重組外膜蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中，將重組外膜蛋白通過親和層析進(jìn)行純化后復(fù)性。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述的抗體檢測板的制備方法為：將純化復(fù)性后的重組外膜蛋白用抗原包被液稀釋為1.5μg/mL的終濃度，向可拆96孔酶標(biāo)板的每個聚苯乙烯微孔中加入100μL，37℃條件下包被2h，用洗滌液洗滌5min×4次，甩干，每孔加封閉液100μL，37℃反應(yīng)3h，用PBST緩沖液洗滌5min×4次，甩干，再加入20%（w/v）蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護(hù)3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存?zhèn)溆谩?/p>

4.按權(quán)利要求3所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述的抗原包被液為PBS緩沖液，所述的洗滌液為PBST緩沖液，所述的封閉液為1%（w/v）牛血清白蛋白的PBST緩沖液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述的辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鴨IgY多克隆抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于：所述的樣品稀釋液為按0.1%（w/v）加入牛血清白蛋白的PBST緩沖液；10×濃縮洗滌液為含0.5%（v/v）吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液；底物顯色液A為0.2mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺溶液，底物顯色液B為含0.05%（v/v）過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液。

7.權(quán)利要求1所述的鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒的應(yīng)用方法，其特征在于包括有以下步驟：

1）將10×濃縮洗滌液稀釋10倍即為洗滌液；

2）將待檢血清用樣品稀釋液按體積1∶100稀釋，按100μl/孔加入到抗體檢測板中，設(shè)陰性對照、陽性對照，并設(shè)只加100μl樣品稀釋液作為空白對照，37℃孵育20-45分鐘，甩干；

3）每孔加步驟1）的洗滌液200μl，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；

4）每孔加100μl的酶結(jié)合物工作液，空白對照不加，37℃孵育20-45分鐘，甩干；

5）每孔加步驟1）的洗滌液200μl，洗滌4次，每次間隔1分鐘，拍干；

6）依次每孔加入50μl底物顯色液A和50μl底物顯色液B，37℃避光孵育5-15分鐘；

7）每孔加50μl終止液，用酶標(biāo)儀在630nm波長下讀取每孔光吸收值。