[發明專利]鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA方法檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201110235293.8
• 申請日: 2011-08-17
• 公開（公告）號: CN102323428A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 張蓉蓉;羅青平;溫國元;邵華斌;艾地云;王紅琳;楊峻;羅玲;楊依霏
• 申請（專利權）人: 湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/531
• 代理公司: 湖北武漢永嘉專利代理有限公司 42102
• 代理人: 崔友明

技術領域

?本發明涉及鴨的一種細菌抗體的快速診斷方法和器具，更具體的講是一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA方法檢測試劑盒及其應用。

背景技術

鴨疫里默氏桿菌病（Riemerellla?anatipestifer?infection,?RAI）是家鴨、火雞和多種其它鳥類的一種接觸傳染性疾病。目前該病呈世界范圍分布，已在所有的集約化養鴨生產的國家發現。該病主要侵害1～8周齡（尤其2～8周齡）雛鴨、雛鵝及雛火雞。該病常呈急性或慢性敗血癥過程，主要以神經癥狀和纖維素性心包炎、肝周炎和氣囊炎為特征。該病的發病率可達9％以上，致死率可高達75％以上，耐過病鴨常常長成殘次鴨或僵鴨，飼料轉化率降低，生長發育遲緩。此外，由該病所引起的輸卵管炎也是影響鴨成年后產蛋率低下的最重要原因之一。

鴨疫里默氏桿菌的血清型復雜，目前公認有21種血清型，在我國血清型發展越來越復雜，藥物預防是我國控制該病的主要措施之一，但目前很多研究報告表明鴨疫里默氏桿菌已對生產上的大多常用藥物產生耐藥性，同時，大量使用藥物也給食品安全造成極大威脅，免疫接種已將逐漸取代藥物預防成為控制該病的安全有效措施之一。

若要開展鴨疫里默氏桿菌病的流行情況和感染范圍的調查，有必要建立一種快速、敏感，特異、便于大規模應用且不需要撲殺動物的血清學檢測診斷方法。

因此研制開發用于鴨疫里默氏桿菌抗體檢測的特異的、敏感的、生物安全度高的、適合于基層使用的診斷檢測的器具，對鴨免疫水平進行實時監控和建立科學、靈活的鴨疫里默氏桿菌的免疫程序、以及對疫病的預防和控制有重要意義。

經有關報道表明鴨疫里默氏桿菌的外膜蛋白ompA基因存在于所有的參考菌株中。在不同的血清型中，ompA基因顯示出較小的異源性。OmpA是一個保守的且強的抗原決定簇，因此，不僅可作為亞單位疫苗的候選成分之一，而且還具有很好的血清學檢測價值。

發明內容

本發明提供了一種用于檢測鴨疫里默氏桿菌抗體的間接ELISA檢測試劑盒，通過pET-28a表達載體構建了能表達鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白基因ompA的載體，并將表達的重組蛋白建立檢測相應抗體，可用于鴨疫里默氏桿菌抗體的檢測。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案：一種鴨疫里默氏桿菌抗體間接ELISA檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括有：a)抗體檢測板，b)酶結合物工作液，c)陽性對照，d)陰性對照，e)樣品稀釋液，f)10×濃縮洗滌液，g)底物顯色液A，h)底物顯色液B和i)終止液，其中：所述的抗體檢測板為包被鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的可拆96孔聚苯乙烯酶標板，酶結合物工作液為辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體，陽性對照為鴨疫里默氏桿菌標準菌株免疫雛鴨制備高免血清，陰性對照為經篩選獲得的未免疫鴨疫里默氏桿菌的雛鴨的陰性血清。

按上述方案，所述的鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的制備方法為：利用PCR技術擴增鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的基因序列，利用基因工程重組技術構建鴨疫里默氏桿菌外膜蛋白的原核表達質粒，命名為pET-28a-OmpA；將質粒pET-28a-OmpA轉入宿主菌大腸桿菌中成為基因工程菌，命名為BLpET-28a-OmpA，將BLpET-28a-OmpA在LB培養基中培養，誘導表達并經SDS-PAGE電泳分析顯示重組外膜蛋白以不溶性包涵體形式存在于菌體中，將重組外膜蛋白通過親和層析進行純化后復性。

按上述方案，所述的抗體檢測板的制備方法為：將純化復性后的重組外膜蛋白用抗原包被液稀釋為1.5μg/mL的終濃度，向可拆96孔酶標板的每個聚苯乙烯微孔中加入100μL，37℃條件下包被2h，用洗滌液洗滌5min×4次，甩干，每孔加封閉液100μL，37℃反應3h，用PBST緩沖液洗滌5min×4次，甩干，再加入20%（w/v）蔗糖磷酸鹽緩沖液室溫保護3小時，置干燥室干燥后，裝入含干燥劑的包裝袋中保存備用。

按上述方案，所述的抗原包被液為PBS緩沖液，所述的洗滌液為PBST緩沖液，所述的封閉液為1%（w/v）牛血清白蛋白的PBST緩沖液。

按上述方案，所述的辣根過氧化物酶標記兔抗鴨IgY多克隆抗體用磷酸鹽緩沖液稀釋。

按上述方案，所述的樣品稀釋液為按0.1%（w/v）加入牛血清白蛋白的PBST緩沖液；10×濃縮洗滌液為含0.5%（v/v）吐溫-20的0.1M磷酸鹽緩沖液；底物顯色液A為0.2mg/ml的四甲基聯苯胺溶液，底物顯色液B為含0.05%（v/v）過氧化氫尿素的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液；終止液為2M硫酸溶液。