[發明專利]一種促進酮古龍酸菌生長和產酸的方法

無效

• 申請號: 201110235170.4
• 申請日: 2011-08-16
• 公開（公告）號: CN102321698A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 熊向華;張惟材;汪建華;韓雙;侯偉
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所
• 主分類號: C12P17/04
• 分類號: C12P17/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及微生物發酵工程領域，具體地說，涉及一種通過添加外源營養因子硫辛酸促進酮古龍酸菌生長和產酸的方法。

背景技術

維生素C(vatamin?C，VC)是一種水溶性維生素，又名L一抗壞血酸(L-ascorbic?acid)，能參與體內多種羥化反應和氧化還原反應，是一類重要的細胞代謝氧化還原化合物，在人體中起著必不可少的生理作用，在醫藥、食品、飼料、化妝品等諸多領域具有重要而廣泛的用途。隨著人們生活水平的提高和對VC的需求不斷增加，促進了對其生產工藝的研究改進，生物發酵法是工業生產VC的發展方向。

我國VC混合菌發酵法生產工藝處于國際領先地位。該方法的第一步是在生黑醋酸桿菌作用下將D一山梨醇氧化為L-山梨糖，俗稱醇糖轉化；第二步是在一種混合菌系的作用下將L-山梨糖進一步氧化為2-酮基-L-古龍酸(2-keto-L-gulonicacid，KGA)，俗稱糖酸轉化，KGA是VC的前體。上述混合菌系包括2種微生物，直接負責山梨糖生物氧化的微生物是普通酮古龍酸菌(Ketogulonigenium?vulgare)，俗稱小菌。另一種微生物俗稱大菌，本身不能轉化山梨糖，作為伴生菌起到輔助小菌生長和產酸的作用，生產中常用的有臘狀芽孢桿菌(Bacillus?cereus)、巨大芽孢桿菌(Bacillus?megaterium)、蘇云金芽孢桿菌(Bacillus?thuringiensis)等。目前VC生產普遍采用我國首創的混合菌發酵法，小菌為產酸菌，但單獨培養生長緩慢，傳代困難，且產酸能力很弱，大菌與小菌混合培養可促進小菌其生長及產酸，但大小菌的混菌發酵給工藝控制增加了難度，造成發酵培養基營養成分和能源的浪費，增加了環境污染，提高了生產成本。

通過單菌發酵實現糖酸轉化一直是VC發酵工藝追求的目標。如果能夠解決小菌單獨生長的問題，完全可以直接利用小菌進行單菌發酵。本發明通過對酮古龍酸菌基因組進行生物信息學分析發現，酮古龍酸菌的硫辛酸的合成代謝途徑中酶不完整，提示酮古龍酸菌自身不能合成這個營養因子，需要從外界攝取。

發明內容

本發明的目的是提供一種提高酮古龍酸菌的生長和產酸速度的方法，實現直接利用小菌進行單菌發酵生產VC的目的，簡化了VC發酵工藝。

為實現上述目的，本發明將硫辛酸應用到酮古龍酸菌的發酵中，可用于VC發酵。硫辛酸是細菌生長所需B族維生素，作為輔酶或輔基的組成成分，是一種酰基載體，在α-酮酸氧化作用和脫羧作用時行使偶聯酰基轉移和電子轉移的功能，在物質代謝中起重要作用。目前國際上用于VC工業生產使用的酮古龍酸菌均來源于同一祖先菌株，表現為單獨生長不良，需要和大菌共培養，從酮古龍酸菌基因組分析，酮古龍酸菌的硫辛酸合成代謝途徑不全，因而在培養基中補充這種營養因子將有利于提高酮古龍酸菌的生長和產酸。

本發明方法可以用含有外源營養因子硫辛酸的HJY基礎培養基發酵培養酮古龍酸菌，和/或在酮古龍酸菌發酵培養的過程中向培養基中添加外源營養因子硫辛酸，并控制發酵條件和時間在一定范圍內。

其中，酮古龍酸菌HJY基礎培養基中硫辛酸的終濃度優選為0.01～5.12mg/L，更優選0.64mg/L。本發明的實施例結果表明，當基礎培養基中的營養因子硫辛酸終濃度為0.64mg/L時，能夠顯著提高酮古龍酸菌的生長和產酸速度。

上述發酵條件優選以酮古龍酸菌Y25為發酵生產菌株，28～32℃，150～250r/min振蕩培養，優選30℃、200r/min振蕩培養。

1L?HJY基礎培養基的配方為15g山梨糖，3g酵母膏，3g玉米漿，15g蛋白胨，4g尿素，2g葡萄糖，0.2g?MgSO₄·12H₂O，4g?CaCO₃，5g?KH₂PO₄，加dH₂O至1L，pH6.8，110℃高壓滅菌25min。

本發明的優選酮古龍酸菌的發酵周期為50～70小時，其生長和產酸的時間均在此范圍內，發酵周期優選60小時。

通過檢測酮古龍酸菌Y25生長60小時后菌液的OD₆₀₀、菌體干重和產酸量來測定營養因子對酮古龍酸菌生長和產酸的促進效果。