[發明專利]一種采用溫度誘導生產重組人表皮生長因子的方法

有效

• 申請號: 201110235048.7
• 申請日: 2011-08-16
• 公開（公告）號: CN102952817A
• 公開（公告）日: 2013-03-06
• 發明（設計）人: 錢悅;甘人寶;侯永泰;吳劍英;張倩;周慶瑋;馮寶山;丁紅珍;杜鵬
• 申請（專利權）人: 上海昊海生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 陳靜

技術領域

本發明屬于生物工程領域；更具體地，本發明涉及通過采用基因工程方法生產重組人表皮生長因子(rhEGF)。

背景技術

人表皮生長因子(Human?epidermal?growth?factor，簡稱hEGF)，是一種由53個氨基酸組成的不含糖基的單鏈多肽，分子內有三對由6個半胱氨酸組成的二硫鍵，形成3個分子內環型結構，組成生物活性所必須的受體結合區域，其分子量為6,216道爾頓，等電點(PI)為4.6。

hEGF是人體中一個重要的細胞因子，是類EGF大家族的一個成員，具有多種生物功能，它可促進外胚層和中胚層細胞，如表皮細胞、成纖維細胞、神經細胞的增殖，并可維持其生長；在生物體發育中，EGF可促進新生兒齒、骨和各器官的生長；可促進肝細胞再生；可促進胃腸粘膜細胞生長和保護粘膜免受損傷等等。

rhEGF在臨床上主要應用于：(1)促進燒傷、各種外科創傷和手術傷口的愈合；(2)促進外科潰瘍的愈合，尤其是糖尿病性潰瘍和老爛腳等愈合；(3)用于皮膚、角膜移植；(4)治療角膜損傷和潰瘍；(5)促進胃、十二指腸潰瘍愈合。近年來，技術人員還將其用于鱗狀細胞癌、皮膚癌的治療，療效顯著。

由于EGF分子內含有三對二硫鍵，因此對酸、堿、熱等理化因素均較為穩定，它是迄今發現的最穩定的多肽。基礎研究表明，EGF具有對皮膚表皮基底層細胞的激活作用，能在分子水平上對細胞進行修復和調整，促進皮膚細胞的新陳代謝，并調節細胞中色素的平衡，可以達到美白、抗皺、延緩衰老的作用。正是由于EGF具有上述特性和作用，因此近年來也被應用于化妝品和美容行業。

目前，大規模制備重組hEGF(rhEGF)多是采用基因工程的方法，所采用的表達系統主要有大腸桿菌表達系統、枯草芽孢桿菌表達系統和酵母表達系統等。

本發明人在先前的研究中，主要將精力放在采用大腸桿菌表達系統分泌表達rhEGF的研究上，并取得了很好的效果，比如，將含有大腸桿菌堿性磷酸酯酶啟動子和信號肽的質粒pAE-8，轉化大腸桿菌宿主菌YK537，得到工程菌株EE-8。該工程菌株在低磷條件下誘導表達rhEGF，最高表達量為150mg/l(中國專利號CN00127953.X)；又如，將化學合成全新設計的phoAspL10基因及其與hEGF的串聯基因，構建表達質粒pBL10EGF(該質粒含有入噬菌體的P_L啟動子)，進而以大腸桿菌BL21(DE3)作為宿主細胞構建工程菌株BE-2，該菌株采用溫度誘導的方式，分泌表達rhEGF至384mg/l(中國專利號CN200510025289.3)。

然而，鑒于市場對于hEGF的需求量很大，本領域還有必要進行更優化的研究，以期進一步提高重組hEGF的產量、簡化生產過程或降低生產成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種采用溫度誘導生產重組人表皮生長因子的方法；以及用于高效表達重組人表皮生長因子的構建物。

在本發明的第一方面，提供一種用于重組表達人表皮生長因子(hEGF)的構建物，其從5’至3’端依次包括以下操作性連接的元件：

噬菌體P_L啟動子，OmpA信號肽基因，人表皮生長因子基因。

在一個優選例中，所述的噬菌體P_L啟動子來源于pBLGlu2；和/或

所述的OmpA信號肽基因和人表皮生長因子基因的序列如SEQ?ID?NO：1所示。

在另一優選例中，所述的構建物是表達載體。

在另一優選例中，所述的噬菌體P_L啟動子和OmpA信號肽基因之間具有限制性內切酶EcoRI酶切位點。

在另一優選例中，所述的人表皮生長因子基因的下游具有限制性內切酶HindIII酶切位點。

在本發明的另一方面，提供一種基因工程菌，其包含前面任一所述的構建物。

在另一優選例中，所述的基因工程菌是大腸桿菌。

在另一優選例中，所述的基因工程菌具有氨芐青霉素抗性。

在本發明的另一方面，提供一種重組表達人表皮生長因子的方法，包括：培養所述的基因工程菌，從而表達人表皮生長因子。

在另一優選例中，先在30℃±2℃(較佳地30±1℃)繁殖基因工程菌至菌體OD₆₆₀值超過30；之后升高培養溫度至38.0±0.5℃(較佳地38.0±0.2℃)，使基因工程菌中所含噬菌體P_L啟動子啟動，誘導分泌表達人表皮生長因子。

在另一優選例中，誘導表達12±2小時；較佳地12±1小時。