[發明專利]糖類抗原19-9(CA19-9)定量測定試劑盒及其檢測方法無效

申請號：	201110234036.2	申請日：	2011-08-16
公開（公告）號：	CN102426256A	公開（公告）日：	2012-04-25
發明（設計）人：	不公告發明人	申請（專利權）人：	內蒙古科慧生物科技有限責任公司
主分類號：	G01N33/96	分類號：	G01N33/96;G01N33/577;G01N33/574;G01N33/543;G01N33/535;G01N33/531;G01N21/64
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摘要：
搜索關鍵詞：	糖類抗原 19 ca19 定量測定試劑盒及其檢測方法
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【權利要求書】：

1.一種糖類抗原CA19-9的定量測定試劑盒，其特征在于，該試劑盒包含CA19-9磁分離試劑，酶反應物，反應增強劑，稀釋液，CA19-9標準品、CA19-9質控品，清洗液濃縮液以及底物溶液。

2.如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的CA19-9磁分離試劑含有標記有抗CA19-9單克隆抗體的磁性微球；

所述的酶反應物是含有堿性磷酸酶標記的抗CA19-9單克隆抗體；

所述的反應增強劑是含有Tris的緩沖液；

所述稀釋液是含有BSA的溶液；

所述的標準品及質控品是含有一定量的CA19-9抗原的BSA溶液；

所述清洗液濃縮液是含有TWEEN-20和Proclin-300的緩沖液；

所述的底物溶液為酶促化學發光底物溶液。

3.如權利要求1-2任其一所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中各組分按照如下制備方法制得：

一、磁分離試劑的制備過程

一)、磁珠緩沖液配制操作步驟，配制1L：

1、稱取TRIS?4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，稱取0.96g?TWEEN-20于20ml容器中加適量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、用移液器將Proclin-300量取0.2ml于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800ml純化水，充分攪拌；

3、調節PH，控制PH在7.95-8.05之間；

4、稱取BSA?3g倒入上述1L容器中；

5、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；

二)、磁分離試劑的制備過程

1、將1.0mg辛二酸二琥珀酰亞胺酯溶于50ul?DMSO中，取2mg抗CA19-9單克隆抗體溶于PH9.5的0.1mol/L?PB緩沖液中至總體積為1ml；

2、用移液槍吸取上述辛二酸二琥珀酰亞胺酯加入到步驟1的抗體溶液中，置室溫90min；

3、將步驟2抗體溶液加入到濃縮管中，然后放入到高速冷凍離心機中在3000g下離心30min濃縮至0.5ml；

4、取0.5ml磁珠，加入5ml反應杯中，經磁鐵吸附2分鐘后吸取上清，然后加入1.5ml?PH9.50.1mol/L?PB，混勻30秒，然后加入步驟3獲得的抗體溶液，混勻后室溫反應4小時；

5、加入0.3ml?1mol/L的TRIS溶液37℃15分鐘，然后加入1.5ml?PH?7.20.1mol/L?PB清洗已經標記的磁珠，混勻30秒；

6、用100ml磁珠保存液將磁珠轉入玻璃瓶；

7、將步驟6獲得的溶液與上述磁珠緩沖液按照1∶1的體積比例混勻，即得權利要求1或2所述試劑盒中的磁分離試劑；

二、酶反應物的制備過程

一)、酶反應物稀釋液配制操作步驟，配制1L：

1、取Tris?6.06g、NaCl?13.0g、Zncl₂?0.05g、Proclin-300?0.2ml和MgCl₂?0.05g于燒瓶中，然后在燒瓶中加入800ml純化水，充分攪拌，使試劑完全溶解；

2、調PH，控制PH在7.35-7.45范圍內；

3、稱取BSA?3g倒入上述燒杯中；

4、最后定容至1000ml，用0.2um濾器過濾即得；

二)、堿性磷酸酶ALP與抗CA19-9單克隆抗體的偶聯

1、取10mgALP加入5ml生理鹽水中，加入到濃縮管中，3000RPM離心20分鐘，濃縮至1毫升；

2、向步驟1獲得濃縮液中加入0.2ml的0.1M?NaIO₄溶液，室溫下避光攪拌20分鐘，然后裝入透析袋中，用1mM?PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析，4℃過夜，收集保留液；

3、向步驟2獲得保留液中加入0.2M?PH9.5碳酸鹽緩沖液，使PH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗CA19-9單克隆抗體，攪拌2小時，再加入0.1ml的4mg/ml?NaBH₄溶液，混勻，置4℃下2小時；

4、將上述溶液裝入透析袋中，用0.15M?PH7.4?PBS透析，4℃過夜，收集保留液；

5、向步驟4獲得保留液中逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時，然后3000rpm離心半小時，棄上清，沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，最后沉淀物溶于20ml的0.15M?PH7.4的PBS中；

6、將步驟5獲得的溶液裝入透析袋中，用0.15M?PH7.4的PB緩沖液透析5個小時去除銨離子，收集保留液后10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，收集上清液，按照體積比為1∶100的比例添加1M?MgCl₂溶液，即得堿性磷酸酶ALP與抗CA19-9單克隆抗體的偶聯物；將收集到的堿性磷酸酶ALP與抗CA19-9單克隆抗體的偶聯物用上述步驟一)獲得的酶反應物稀釋液以1∶1000的體積比混合均勻，即得酶反應物。

三、反應增強劑的制備過程，配制1L：

1、取TRIS1.56g和NaCl?4.23g于1L容器中，取0.2ml?Proclin-300于10ml純化水的燒杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；

2、取800ml純化水于上述1L容器中，充分攪拌直至完全溶解，調PH在7.35-7.45之間；

3、稱取Mak33?0.9g于上述1L容器中；最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；

四、稀釋液的制備過程，配制1L：

1、稱取NaCl9.0g和BSA?60g于1L的容器中；

2、取0.5ml?Proclin-300加10ml純化水溶解，倒入上述1L的容器中；

3、最后定容1000ml，完全溶解后，用0.2um濾器過濾即得；

五、CA19-9校準品和CA19-9質控品的配制：

CA19-9校準品中CA19-9抗原的濃度分別為10、40、100、200、400U/ml；CA19-9質控品中CA19-9抗原的濃度分別為40、200U/ml；

六、清洗液濃縮液的制備過程，配制1L：

1、取TRIS?12.54g和NaCl?325.6g于1L容器中；