[發明專利]利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法

有效

• 申請號: 201110232962.6
• 申請日: 2011-08-13
• 公開（公告）號: CN102296047A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 萬鵬程;石國慶;倪建宏;石文艷;郭洪;代蓉;劉長彬;張賓
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 李伯勤

技術領域

本發明涉及一種利用羔羊卵巢中卵母細胞在體外生產胚胎的方法，特別是一種利用羔羊超數排卵后卵巢中卵母細胞在體外生產胚胎的方法。

背景技術

目前牧業生產中，新品種的繁育決定著經濟效益高低。而有實際生產中，一些優良品種在推廣繁育過程中往往受到來自各方面因素的影響，一是優良品種胚胎供體或來源的不足，二是胚胎生產平臺或載體的的瓶頸，都會制約新的優良品種的推廣和繁育。

因此，一種利用羔羊卵巢中卵母細胞在體外生產胚胎的方法，特別是一種利用羔羊超數排卵后卵巢中卵母細胞在體外生產胚胎的方法就應運而生。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用羔羊卵巢中卵母細胞在體外生產胚胎的方法，特別是一種利用羔羊超數排卵后的卵巢中卵母細胞在體外生產胚胎的方法。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

成熟液配制：在M199培養基原液中加入：?8～12μg/mL?FSH(促卵泡素)、8～12μg/mL?LH?(促黃體素)、0.5～1.5μg/mL?E2?（雌激素）、0.05～0.15mmol/L?β-巰基乙醇和10～20%ESS（發情母羊血清），培養液在使用前制作成40～60μL/滴的成熟液微滴，在培養箱中平衡1～3h。

卵母細胞培養：將采集到的COCs(卵丘-卵母細胞復合體)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10～20枚卵母細胞為好，在38～39℃、4~6%?CO_2?、飽和濕度環境下培養22～26h，COCs中的卵母細胞成熟為卵子。

上述COCs最好先在成熟液中洗滌1～2次后，再移入成熟液微滴中進行培養。

受精液配配制：在SOF(輸卵管合成液)中加入：0.1～0.2?μmol/L青霉胺（Penicillamine）、0.1～0.2?μmol/L亞牛磺酸（Hypotaurine）、5～10?μg/mL肝素（Heparin）和2～10%?ESS（發情母羊血清），在受精前1～2h，在培養皿或培養板中制做受精液滴，每滴40～60μL。

所述受精液滴在制作后最好覆蓋上石蠟油。

精液處理：取新鮮或者解凍后的精液，稀釋成4×10⁶?～6×10⁶?/mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入8～12μL精子稀釋液，將受精液滴連同培養皿或培養板一同放入CO₂培養箱中平衡2h以上。

上述的精液，最好采用Percoll?梯度（45%/90%）離心法收集活力較好的精子，之后再進行稀釋。

體外受精：將成熟液中的成熟卵子按每個受精液滴中30～50個成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38～39℃、4～6%?CO_2?、飽和濕度環境的培養箱中進行體外受精并培養18～24h。

所述的成熟卵子最好在HSOF中洗滌2～4次后，再移入受精液滴中進行體外受精和培養。

上述的受精液滴在移入成熟卵子后之后最好再在每滴受精液滴中加入5～10μL精子稀釋液。

上述成熟液中培養的成熟卵子在使用前最好將卵子間相互分離，所述分離用采用移液器在原成熟盤中反復吹打培養成熟COCs方法實現。

胚胎發育液為配制：在SOF?中加入?1～3%?BME(EAA)?（必需氨基酸）、1～3%?MEM(NEAA)（非必需氨基酸）、0.5～5%?BSA（胎牛血清）、0.05～0.15?mmol/mL?Glutamine(谷氨酰胺)?和0.4～6?mg/mL?Mys-Inositol（肌醇），將胚胎發育液按照50-100μl的容積在培養板或培養皿上做成液滴狀，在培養箱中平衡1-3h。

所述胚胎發育液滴在制作后最好覆蓋上石蠟油。

受精卵子培養：精子與卵子受精培養18～24h后，除去受精卵子周圍的顆粒細胞和附著的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎發育液滴中，在飽和濕度的培養箱中，38～39℃、4～6%CO₂下進行體外培養6-8天，受精卵子即發育為胚胎，此時即可將成活的胚胎殖入代孕母羊體內發育成胎兒。

上述的卵母細胞的采集：最好選擇性成熟前的雌性羔羊進行采集，優先選擇出生后4-10周齡的性成熟前的雌性羔羊。

采集前最好經PMSG-FSH(孕馬血清聯合促卵泡素)作超數排卵處理2～5次，每次間隔12小時；手術法取出并固定卵巢，注射器抽取COCs（卵丘-卵母細胞復合體）。