[發明專利]利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法

有效

• 申請號: 201110232962.6
• 申請日: 2011-08-13
• 公開（公告）號: CN102296047A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 萬鵬程;石國慶;倪建宏;石文艷;郭洪;代蓉;劉長彬;張賓
• 申請（專利權）人: 新疆農墾科學院
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 李伯勤

1.一種利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：通過以下過程實現：

成熟液配制：在M199培養基原液中加入：?8～12μg/mL?FSH(促卵泡素)、8～12μg/mL?LH?(促黃體素)、0.5～1.5μg/mL?E2?（雌激素）、0.05～0.15mmol/L?β-巰基乙醇和10～20%ESS（發情母羊血清），培養液在使用前制作成40～60μL/滴的成熟液微滴，在培養箱中平衡1～3h；

卵母細胞培養：將采集到的COCs(卵丘-卵母細胞復合體)移入成熟液微滴中，每滴成熟液微滴中移入10～20枚卵母細胞，在38～39℃、4~6%?CO_2?、飽和濕度環境下培養22～26h，COCs中的卵母細胞成熟為卵子；

受精液配配制：在SOF(輸卵管合成液)中加入：0.1～0.2?μmol/L青霉胺（Penicillamine）、0.1～0.2?μmol/L亞牛磺酸（Hypotaurine）、5～10?μg/mL肝素（Heparin）和2～10%?ESS（發情母羊血清），在受精前1～2h，在培養皿或培養板中制做受精液滴，每滴40～60μL；

精液處理：取新鮮或者解凍后的精液，稀釋成4×10⁶?～6×10⁶?/mL的精子稀釋液，在所述的每個受精液滴中移入8～12μL精子稀釋液，將受精液滴連同培養皿或培養板一同放入CO₂培養箱中平衡2h以上；

體外受精：將成熟液中的成熟卵子按每個受精液滴中30～50個成熟卵子的比例移入受精液滴中，然后放入在38～39℃、4～6%?CO_2?、飽和濕度環境的培養箱中進行體外受精并培養18～24h；

胚胎發育液為配制：在SOF?中加入?1～3%?BME(EAA)?（必需氨基酸）、1～3%?MEM(NEAA)（非必需氨基酸）、0.5～5%?BSA（胎牛血清）、0.05～0.15?mmol/mL?Glutamine(谷氨酰胺)?和0.4～6?mg/mL?Mys-Inositol（肌醇），將胚胎發育液按照50-100μl的容積在培養板或培養皿上做成液滴狀，在培養箱中平衡1-3h；

受精卵子培養：精子與卵子受精培養18～24h后，除去受精卵子周圍的顆粒細胞和附著的精子，以15-40枚/滴的密度放入胚胎發育液滴中，在飽和濕度的培養箱中，38～39℃、4～6%CO₂下進行體外培養6-8天。

2.根據權利要求1所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述COCs先在成熟液中洗滌1～2次后，再移入成熟液微滴中進行培養；所述的成熟卵子在HSOF中洗滌2～4次后，再移入受精液滴中進行體外受精和培養；所述受精卵子在胚胎發育液中清洗1-2次后，再放入胚胎發育液滴中進行培養；

所述HSOF?為：含有8～12?mmol/L?hepes（4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸）的SOF。

3.根據權利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述受精液滴和胚胎發育液滴在制作后覆蓋上石蠟油。

4.根據權利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述的精液采用Percoll?梯度（45%/90%）離心法收集活力較好的精子，之后再進行稀釋。

5.根據權利要求3所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述的精液采用Percoll?梯度（45%/90%）離心法收集活力較好的精子，之后再進行稀釋。

6.根據權利要求1或2所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5～10μL精子稀釋液。

7.根據權利要求3所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5～10μL精子稀釋液。

8.根據權利要求4所述的利用羔羊超排卵母細胞生產體外胚胎的方法，其特征在于：所述的受精液滴在移入成熟卵子之后再在每滴受精液滴中加入5～10μL精子稀釋液。