[發明專利]表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途

有效

• 申請號: 201110232341.8
• 申請日: 2011-08-15
• 公開（公告）號: CN102294055A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 沈雁;戴麗冰;李孝建;梁蓉
• 申請（專利權）人: 沈雁;戴麗冰;李孝建;梁蓉
• 主分類號: A61L27/60
• 分類號: A61L27/60;C12N5/074
• 代理公司: 廣州廣信知識產權代理有限公司 44261
• 代理人: 李玉峰

技術領域

本發明涉及組織工程皮膚技術領域，尤其涉及一種以幾丁質膜作為支架培養表皮干細胞構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途。

背景技術

大面積創面處理離不開覆蓋物，有時甚至需要進行皮膚移植，但自體皮源不足而限制了手術實施。現有技術的人工皮膚研究中，通常使用表皮細胞、成纖維細胞等終末細胞加入支架材料，以構成有一定生物活性的復合皮，但這類終末細胞，增殖能力較弱，影響修復效果。以往組織工程皮膚的種子細胞中，表皮成分主要是來源于自體或異體的表皮細胞，雖然不斷改進培養體系，縮短周期或建立表皮細胞株，但尚無突破性進展。真皮種子細胞主要來源于成纖維細胞，取材方便生長速度較快，但功能單一，對構建皮膚附屬器無明顯優勢。由于表皮干細胞(epidermis?stem?cells，ESCs)具有很大的可塑性，是潛在的多能干細胞，在合適條件下可誘導形成汗腺、毛發和毛囊等皮膚附屬器，從而在解決表皮成分的種子細胞上具有優勢。而ESCs的培養及其與載體的結合，是構建組織工程皮膚的關鍵所在。

幾丁質膜作為一種生物材料，除了具有良好的組織相容性和生物學性能外，還具有來源廣泛、價格低廉、性質穩定及重復性好等優點，是構建組織工程皮膚的較好選擇。本發明人以幾丁質膜作為介質支架，體外與ESCs共同培養，取得了突破性進展，ESCs在幾丁質膜纖維1～2w上形成集落，為ESCs作為種子細胞構建仿生覆蓋物并實現誘導組織再生、功能重建提供了基礎。但仍然存在著以下缺陷：幾丁質生物膜材料孔徑較大(500～1000nm)、網格不均勻、致密性差，僅適合用于傷口的暫時性覆蓋，不利于細胞的貼附及立體生長，細胞容易遺漏，細胞貼附量有限，從而影響了表皮干細胞分化為表皮細胞的能力，不能很好地促進創面愈合，難以獲得理想的創面修復效果。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種對幾丁質膜進行表面修飾改性后與表皮干細胞共同培養構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，使表皮干細胞在支架材料上均勻地、充分鋪展并具有良好的生長狀態，以利于表皮干細胞在創面中從毛囊干細胞向表皮細胞分化，并產生毛囊等附屬器，從而獲得理想的創面修復效果，實現病損組織的形態和結構再生、功能重建。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

本發明提供的一種表皮干細胞-修飾幾丁質膜構建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，采用來源于成體皮膚組織的表皮干細胞與修飾幾丁質膜共同培養制備，包括以下步驟：

a)表皮干細胞的分離和培養

取大鼠或小兒包皮全層皮膚，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細胞，洗滌后加入DK-SFM培養液，移至用IV型膠原預包被的培養瓶內，37℃下靜置10～15min，貼壁細胞即為表皮干細胞(ESCs)；棄去未貼壁的細胞懸液，加入DK-SFM培養液常規培養，取第2-3代細胞用于實驗；

b)采用膠原混合液表面修飾幾丁質膜

b-1)膠原混合液的制備

在冰上進行如下操作：將無菌10×PBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮1N?NaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml?I型膠原∶10×PBS∶1N?NaOH＝0.5～1.5∶0.25～0.75∶0.05～0.15，無菌蒸餾水補足總量，混合后I型膠原的終濃度為0.25～3mg/ml；為減少或避免產生氣泡，混合采用吸管上下吸勻的方式進行，如出現氣泡采用離心方式去除；放置15min獲得膠原混合液；

b-2)修飾幾丁質膜

根據模具，幾丁質膜裁成呈正方形、且雙層十字型放置，在其上加入所述膠原混合液，膠原混合液的添加量為0.2～0.4ml/cm²幾丁質膜面積，冰上放置30min～1h，然后放置在37℃孵育箱45min～1h，促進膠體形成；之后在溫度-70～-80℃下預冷20h或過夜，-30～-40℃冷凍真空干燥20～25h；Co60?5～10Kgy輻照，連續3～5次交聯并滅菌而獲得修飾幾丁質膜；所述修飾幾丁質膜具有圖案式的均勻網格結構，網格孔徑為2～10nm；

c)表皮干細胞-修飾幾丁質膜共培養