[發(fā)明專利]表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法及其用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110232341.8
• 申請(qǐng)日: 2011-08-15
• 公開（公告）號(hào): CN102294055A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 沈雁;戴麗冰;李孝建;梁蓉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈雁;戴麗冰;李孝建;梁蓉
• 主分類號(hào): A61L27/60
• 分類號(hào): A61L27/60;C12N5/074
• 代理公司: 廣州廣信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44261
• 代理人: 李玉峰

1.一種表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：采用來源于成體皮膚組織的表皮干細(xì)胞與修飾幾丁質(zhì)膜共同培養(yǎng)制備，包括以下步驟：

a)表皮干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

取大鼠或小兒包皮全層皮膚，中性蛋白酶消化過夜，從表皮基底層提取單細(xì)胞，洗滌后加入DK-SFM培養(yǎng)液，移至用Ⅳ型膠原預(yù)包被的培養(yǎng)瓶內(nèi)，37℃下靜置10～15min，貼壁細(xì)胞即為表皮干細(xì)胞；棄去未貼壁的細(xì)胞懸液，加入DK-SFM培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，取第2-3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)；

b)采用膠原混合液表面修飾幾丁質(zhì)膜

b-1)膠原混合液的制備

在冰上進(jìn)行如下操作：將無菌10×PBS、無菌蒸餾水、無菌新鮮1NNaOH混合配制平衡液，然后將I型膠原加入所述平衡液混合均勻；其中按照體積比5mg/ml?I型膠原∶10×PBS∶1N?NaOH＝0.5～1.5∶0.25～0.75∶0.05～0.15，無菌蒸餾水補(bǔ)足總量，混合后I型膠原的終濃度為0.25～3mg/ml；放置15min獲得膠原混合液；

b-2)修飾幾丁質(zhì)膜

根據(jù)模具，幾丁質(zhì)膜裁成呈正方形、且雙層十字型放置，在其上加入所述膠原混合液，膠原混合液的添加量為0.2～0.4ml/cm²幾丁質(zhì)膜面積，冰上放置30min～1h，然后放置在37℃孵育箱45min～1h，促進(jìn)膠體形成；之后在溫度-70～-80℃下預(yù)冷20h或過夜，-30～-40℃冷凍真空干燥20～25h；Co60?5～10Kgy輻照，連續(xù)3～5次交聯(lián)并滅菌而獲得修飾幾丁質(zhì)膜；

c)表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜共培養(yǎng)

修飾幾丁質(zhì)膜使用時(shí)用培養(yǎng)液平衡后待用；貼壁培養(yǎng)的表皮干細(xì)胞消化后制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為1×10⁶～2×10⁶個(gè)/ml，表面種植濃縮為0.2～0.5ml細(xì)胞懸液，滴加在修飾幾丁質(zhì)膜表面，靜置30min～1h后，加入含5～10％胎牛血清的DK-SFM培養(yǎng)液，于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中，常規(guī)培養(yǎng)1～2w，隔天換液，獲得表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜仿生皮膚覆蓋物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：所述步驟b-1)中，所述平衡液的pH為6.9～7.2。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：所述步驟b-1)中，混合后I型膠原的終濃度為0.25～0.5mg/ml。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：所述步驟b-1)中，I型膠原為從大鼠鼠尾、豬筋腱、牛筋腱提取的I型膠原。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：所述步驟b-1)中，I型膠原與平衡液的混合采用吸管上下吸勻的方式進(jìn)行溫和混合，如有氣泡采用離心方式去除。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：所述步驟b-2)中，采用Co60?5Kgy輻照，連續(xù)4～5次交聯(lián)并滅菌。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建仿生皮膚覆蓋物的制備方法，其特征在于：所述步驟b-2)中，修飾幾丁質(zhì)膜具有圖案式的均勻網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，網(wǎng)格孔徑為2～10nm。

8.權(quán)利要求1-7之一所述表皮干細(xì)胞-修飾幾丁質(zhì)膜構(gòu)建的仿生皮膚覆蓋物，其特征在于：用于皮膚組織工程淺層與全層創(chuàng)面修復(fù)。