[發(fā)明專利]腦鈉肽的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110232338.6
• 申請日: 2011-08-15
• 公開（公告）號: CN102277371A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 范文超;柳鵬福;吳黎誠;劉萍
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院湖州工業(yè)生物技術中心
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/575;C07K1/14;C12R1/19
• 代理公司: 湖州金衛(wèi)知識產權代理事務所(普通合伙) 33232
• 代理人: 趙衛(wèi)康

技術領域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥工程技術領域，涉及一種基因工程方法構建腦鈉肽重組工程菌，進而發(fā)酵、純化制備腦鈉肽的方法。

背景技術

腦鈉肽?(?brain?natriuretic?peptide，BNP)又稱B型利鈉肽?(?B-?type?natriuretic?peptide)，是繼心鈉肽(ANP)后利鈉肽系統(tǒng)的又一成員，于1988年首先在豬腦中被發(fā)現(xiàn)，隨后的研究發(fā)現(xiàn)腦鈉肽主要在心室心肌中合成并分泌，可以促進排鈉、排尿，舒張血管，具有較強的抗血管平滑肌細胞及內皮細胞的增殖作用，并能對抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(?RAAS)的縮血管作用，對人體水和電解質的平衡，心血管、內分泌系統(tǒng)的調節(jié)起著重要作用。

BNP是由?32個氨基酸組成的多肽片段，分子量約為3.4kDa，在心肌細胞內首先合成其激素原前體，經裂解去除一個26氨基酸的信號肽，以含108氨基酸的激素前體proBNP形式分泌至細胞內，并裂解成為無活性的N末端(?NT-?BNP)和有活性的BNP(含32個氨基酸的C端片段)。2001年?8月美國?SCIOS公司生產的基因重組人腦鈉肽?(?recombinant?human?BNP，rhBNP)-Nesiritide上市，成為新一代靜脈注射用治療失代償性心力衰竭的藥物。

腦鈉肽的制備主要有化學合成法和基因工程法，其中化學合成腦鈉肽成本高、價格昂貴，產業(yè)化困難。用基因重組技術生產的人腦鈉肽是解決這個問題的有效途徑,?通常將編碼BNP的基因克隆到大腸桿菌中，通過大規(guī)模發(fā)酵基因工程大腸桿菌來大量表達目標蛋白，進而通過分離純化，得到符合要求的BNP。常規(guī)大腸桿菌表達外源蛋白常會導致目標蛋白在胞內積累而限制其表達量，發(fā)酵結束后需要破碎細胞才能回收目標蛋白并進一步分離純化，細胞破碎的過程中，胞內其它蛋白和細胞組分一起釋放出來，體系中復雜的組分使得純化的收率和成本大大增加。另外，多肽因其分子小，直接表達存在困難，一般需要采用融合表達技術。目前研究采用的融合表達分為自身串聯(lián)融合表達和與其它載體蛋白融合表達兩種，大都在胞內積累，易形成包涵體，而從包涵體復性具有生物活性的蛋白，需要經過一系列的變性復性過程，其代價是非常昂貴的。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為解決上述技術問題，提供一種腦鈉肽的制備方法。

本發(fā)明的上述技術目的具體是通過以下技術方案得以實現(xiàn)的：

腦鈉肽的制備方法，包括以下步驟：

①設計并合成BNP的基因序列，具體序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCATTAAGCTT?；

②將合成的基因序列用KpnI和HindIII酶切，裝載于同樣酶切的載體pET32a上，用DNA連接酶連接后，轉化大腸桿菌，得到大腸桿菌轉化子，抽提該大腸桿菌轉化子的質粒，然后構建完成表達載體pET32a-BNP；

③將上述表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3），得到基因工程菌；

④對該基因工程菌進行發(fā)酵，發(fā)酵過程中加入IPTG和曲拉通X-100；

⑤利用融合蛋白耐高溫的特性，將發(fā)酵液加熱處理，然后離心除去雜蛋白，初步純化并濃縮目的蛋白；

⑥將濃縮后的目的蛋白加入緩沖液，過層析柱，使得含有6×His標簽的融合蛋白得以進一步濃縮，除去雜蛋白，得到高純度的融合蛋白；

⑦在合適的酶切條件下，利用腸激酶酶切高純度的融合蛋白，使得融合標簽和腦鈉肽斷裂。

作為上述技術方案的優(yōu)選，它還包括以下步驟：

⑧經腸激酶酶切后的蛋白，配制成溶液后再過層析柱，使得融合標簽與樹脂結合，目標產物富集于穿透液中；

⑨收集上述穿透液，過凝膠層析柱，除去殘留的腸激酶及其它殘留雜蛋白，收集目標產物;

⑩將上述溶液凍干，得到純的多肽產品。

作為上述技術方案的優(yōu)選，步驟④中曲拉通X-100的加入量為0.1%（m/v）。

作為上述技術方案的優(yōu)選，步驟⑥所述中層析柱為Ni²⁺親和層析柱。

作為上述技術方案的優(yōu)選，步驟⑧所述中層析柱為Ni²⁺親和層析柱。

本發(fā)明具有以下有益效果：