[發明專利]腦鈉肽的制備方法無效
| 申請號： | 201110232338.6 | 申請日： | 2011-08-15 |
| 公開（公告）號： | CN102277371A | 公開（公告）日： | 2011-12-14 |
| 發明（設計）人： | 范文超;柳鵬福;吳黎誠;劉萍 | 申請（專利權）人： | 中國科學院上海生命科學研究院湖州工業生物技術中心 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C07K14/575;C07K1/14;C12R1/19 |
| 代理公司： | 湖州金衛知識產權代理事務所(普通合伙) 33232 | 代理人： | 趙衛康 |
| 地址： | 313000 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 腦鈉肽 制備 方法 | ||
1.腦鈉肽的制備方法，包括以下步驟：
①設計并合成BNP的基因序列，具體序列如下，GGTACCGACGACGACGACAAAAGCCCCAAGATGGTGCAAGGGTCTGGCTGCTTTGGGAGGAAGATGGACCGGATCAGCTCCTCCAGTGGCCTGGGCTGCAAAGTGCTGAGGCGGCATTAAGCTT?；
②將合成的基因序列用KpnI和HindIII酶切，裝載于同樣酶切的載體pET32a上，用DNA連接酶連接后，轉化大腸桿菌，得到大腸桿菌轉化子，抽提該大腸桿菌轉化子的質粒，然后構建完成表達載體pET32a-BNP；
③將上述表達載體轉入大腸桿菌BL21（DE3），得到基因工程菌；
④對該基因工程菌進行發酵，發酵過程中加入IPTG和曲拉通X-100；
⑤利用融合蛋白耐高溫的特性，將發酵液加熱處理，然后離心除去雜蛋白，初步純化并濃縮目的蛋白；
⑥將濃縮后的目的蛋白加入緩沖液，過層析柱，使得含有6×His標簽的融合蛋白得以進一步濃縮，除去雜蛋白，得到高純度的融合蛋白；
⑦在合適的酶切條件下，利用腸激酶酶切高純度的融合蛋白，使得融合標簽和腦鈉肽斷裂。
2.根據權利要求1所述的腦鈉肽的制備方法，其特征在于，它還包括以下步驟：
⑧經腸激酶酶切后的蛋白，配制成溶液后再過層析柱，使得融合標簽與樹脂結合，目標產物富集于穿透液中；
⑨收集上述穿透液，過凝膠層析柱，除去殘留的腸激酶及其它殘留雜蛋白，收集目標產物;
⑩將上述溶液凍干，得到純的多肽產品。
3.根據權利要求1所述的腦鈉肽的制備方法，其特征在于：步驟④中曲拉通X-100的加入量為0.1%。
4.根據權利要求1所述的腦鈉肽的制備方法，其特征在于：步驟⑥所述中層析柱為Ni2+親和層析柱。
5.根據權利要求2所述的腦鈉肽的制備方法，其特征在于：步驟⑧所述中層析柱為Ni2+親和層析柱。
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