[發明專利]IBDV無血清微載體懸浮培養增殖的方法

無效

• 申請號: 201110231805.3
• 申請日: 2011-08-15
• 公開（公告）號: CN102268411A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 吳培培;馮磊;王偉峰;侯繼波
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

技術領域

本發明涉及將雞傳染性法氏囊病毒在無血清培養基及微載體的懸浮培養Vero上的增殖，屬于生物工程技術領域。

背景技術

雞傳染性法氏囊病（Infectious?Bursal?Disease,IBD），是由傳染性法氏囊病毒（IBDV）引起的雞的一種高度接觸性傳染病，最早發生于美國Delaware州的Gamboro地區，主要感染3~6周齡的青年雞，病毒在法氏囊的淋巴細胞中迅速繁殖，損傷法氏囊的B淋巴細胞，引起嚴重的免疫抑制。1980年以后該病傳入我國并大面積暴發和持續流行，嚴重影響了我國養雞業的發展，當前對于該病普遍采用接種疫苗的進行預防。

目前，國內生產IBDV疫苗大部分采用雞胚培養增殖病毒或有血清培養的雞胚成纖維細胞。在培養基中添加一定量的新鮮血清，常用胎牛血清或小牛血清，因為血清可供給細胞營養成份，血清中的激素可刺激細胞生長，血清中的許多結合蛋白對激素、維生素和脂類等有穩定和調節作用。但是，培養基中含有血清成份，用以制造疫苗可誘發過敏反應，對提純和收獲細胞產物帶來很大困難，加上每批血清的質量不同，從而影響疫苗的穩定性。

由血清使用所造成的細胞培養過程和細胞表達產物安全性的不確定因素增加的現實問題，成為動物細胞無血清培養技術研究和應用的發展動因。隨著動物細胞無血清培養技術的不斷進步，為包括Vero細胞在內的動物細胞大規模無血清培養技術的應用提供了必要的技術支撐，無血清培養已成為包括疫苗在內的生物技術藥物生產的總趨勢。2010年，美國、歐盟和日本等發達國家將全面停止在生物制藥中應用血清，FDA將停止含血清細胞培養工藝生產的生物技術新藥的申報受理。

當前，國內普遍使用轉瓶接種IBDV的生產方式，培養體積0.5L左右，無法進行大規模制備。國外已經使用微載體在生物反應器中培養Vero細胞生產部分病毒性疫苗產品，國內個別企業通過引進技術已經使用微載體Vero細胞生產疫苗。

發明內容

本發明的目的是提供一種IBDV病毒在無血清培養基以及微載體懸浮培養的Vero細胞上增殖的方法，本發明的另一個目的是篩選出適合IBDV病毒在無血清培養基培養條件下增殖新的培養基成分，適合大批量病毒的制備，并避免了血清中攜帶外源性病毒的危害。

本發明的IBDV無血清微載體懸浮培養增殖的方法，包括下列步驟：

1）Vero細胞的無血清培養的馴化：逐步降低Vero細胞培養基中的血清濃度，在15代之內將血清降低到0.2%；將低血清培養的細胞轉到無血清培養基中培養，待細胞適應后，擴增細胞作為種子庫細胞；

2）IBDV病毒增殖：將馴化的細胞接種到含0.25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基，待細胞粘附到微載體并開始生長時接種IBDV病毒，90h收獲病毒。

優選地，

所說的步驟2）中IBDV病毒增殖具體包括以下步驟：

1）將無血清培養的Vero細胞消化后離心，按照3~4×10⁵cell/mL的初始密度重懸到病毒維持液中；病毒維持液成分為含0.25%的乳清蛋白水解物的無血清培養基IVT；細胞初始培養條件為pH值7.1、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37℃；

2）待細胞在微載體上貼附后，接種IBDV病毒，接種病毒時的微載體的粘球率達到40~50%；病毒接種量：病毒以0.01~0.2的感染復數接種；IBDV病毒增殖期間，維持條件：pH值7.2、懸浮培養攪拌速度35rpm、溶氧30%、溫度37℃，接種90h收獲病毒。

本發明對從ATCC引進的Vero細胞進行馴化，降血清的培養，最終獲得無血清微載體培養條件下的Vero細胞，同時改進IBDV病毒增殖時培養基成分，減少外源性病毒的影響，提高IBDV在無血清微載體培養條件下的病毒效價。通過優化病毒繁殖培養基增殖的IBDV病毒效價高于未優化培養基增殖的IBDV和采用雞胚成纖維細胞增殖的IBDV病毒效價；與Vero細胞有血清培養的IBDV相當；免疫原性實驗表明：該病毒的免疫原性強，適合作為疫苗生產。

附圖說明

圖1是經馴化的Vero細胞在無血清培養時細胞形態；

圖2是經馴化的Vero細胞在無血清微載體懸浮培養時細胞形態；

圖3是經馴化的Vero細胞在無血清微載體懸浮培養時的具體生長曲線；

圖4是無血清培養Vero細胞微載體懸浮培養增殖IBDV?的細胞形態（接毒后24h、48h、72h、90h）；

圖5不同培養方式增殖的IBDV效價比較。

具體實施方式