[發明專利]抗菌肽LF-TH及其大腸桿菌重組制備方法

無效

• 申請號: 201110231087.X
• 申請日: 2011-08-12
• 公開（公告）號: CN102276729A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 馮興軍;盛尊來;馬德星;郭佳音;李靜
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/70;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 金永煥

技術領域

本發明涉及抗菌肽及其制備方法。

背景技術

抗生素長期廣泛使用所帶來的一系列問題如菌群失調、耐藥菌株的增加以及藥物的毒副反應等負面效果日趨嚴重，尤其是菌株耐藥性已經成為抗生素無法解決的問題，研究開發新型有效的抗菌藥物已成當務之急。抗菌肽是生物體內一類具有重要免疫作用的多肽，是機體非特異性免疫功能的重要組成部分。抗菌肽具有分子量小、熱穩定、水溶性好、抗菌譜廣等特點。抗菌肽具有獨特的不同于抗生素的作用機制，菌株不易對其產生耐藥性。抗菌肽由于自身的優良特性成為一種新的抗菌藥物的研究開發熱點。

抗菌肽的價格與制備是困擾抗菌肽應用的限制性瓶頸，利用基因工程方法重組制備抗菌肽為解決抗菌肽規模化制備提供了有效手段。到目前為止，在自然界中已經發現超過1000多種抗菌肽。然而天然抗菌肽抗菌活性不強，有些抗菌肽對真核生物細胞具有細胞毒性，引起宿主動物紅細胞溶血。為此，研究人員通過許多不同的方法與手段完善抗菌肽分子的生物學功能，如將不同抗菌肽分子進行雜合、將抗菌肽分子截短、氨基酸替換、C端酰胺化等都是在改善抗菌肽分子生物學活性研究中常用的方法。許多研究表明，不同抗菌肽分子的雜合是提高抗菌肽活性、消除或降低抗菌肽細胞毒性與溶血活性的有效方法，在研究抗菌肽分子構效關系與分子設計中經常被采用。

乳鐵蛋白(Bovine?Lactoferricin，LfcinB)是牛乳鐵蛋白降解得到的陽離子型抗菌肽，廣泛存在于哺乳動物多種組織及粘膜層，參與機體的非特異性體液免疫。最早由Bellamy在1992年分離得到的，其抗菌活性比牛乳鐵蛋白強400多倍，具有免疫原性小、水溶性好、廣譜殺菌甚至能夠殺真菌、原蟲等優點，能夠耐受胃腸道中蛋白酶及肽酶的降解。死亡素(Thanatin，Th)是在昆蟲斑腹刺益蝽中發現的抗菌譜最廣的抗菌肽之一，對革蘭氏陽性、革蘭氏陰性菌以及真菌均有作用，但是對酵母影響不大。死亡素對哺乳動物細胞沒有溶血性。

發明內容

本發明的目的是為了解決現有抗菌肽抗菌活性不高的問題，而提供抗菌肽LF-TH及其大腸桿菌重組制備方法。

抗菌肽LF-TH的氨基酸序列包括33個氨基酸，其氨基酸序列如下：PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysProValProIleIleTyrCysAsnArgArgThrGlyLysCysGlnArgMet(即FKCRRWQWRWKKLGAKPVPIIYCNRRTGKCQRM)，其編碼基因序列如SEQ?ID?No.2所示。

抗菌肽LF-TH的大腸桿菌重組制備方法按以下步驟進行：

一、選取LfcinB的第1～15位氨基酸序列Lfcin?B(1～15)，其中的第十位氨基酸由Met替換為Trp，選取Thanatin的第4～21位氨基酸序列Th(4～21)，將Lfcin?B(1～15)與Th(4～21)連接，設計抗菌肽LF-TH，然后根據大腸桿菌密碼子偏愛性設計抗菌肽LF-TH的編碼基因；

二、將抗菌肽LF-TH的編碼基因與質粒pET-32a(+)連接，構建重組大腸桿菌表達載體，轉化宿主細胞E.coli?BL21(DE3)，IPTG誘導表達后，離心收集菌體，超聲波裂解、離心收集上清液，利用Ni-NTA層析柱、蛋白純化儀獲得目的重組融合蛋白，然后腸激酶裂解目的重組融合蛋白釋放抗菌肽LF-TH，經RP-HPLC純化后獲得抗菌肽LF-TH，即完成抗菌肽LF-TH的大腸桿菌重組制備；

其中步驟一中抗菌肽LF-TH的氨基酸序列包括33個氨基酸，其氨基酸序列如下：PheLysCysArgArgTrpGlnTrpArgTrpLysLysLeuGlyAlaLysProValProIleIleTyrCysAsnArgArgThrGlyLysCysGlnArgMet；

步驟一中抗菌肽LF-TH的編碼基因序列如SEQ?ID?No.2所示。

本發明制備的抗菌肽LF-TH抗菌活性高，對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌和鼠傷寒沙門氏菌具有明顯的抑制作用，抗菌活性明顯改善，拓寬了抗菌譜，且無細胞溶血性與動物毒性。本發明利用大腸桿菌表達系統成功實現了重組制備，獲得了抗菌活性和抗菌譜都有改善的抗菌肽LF-TH，拓寬了抗菌肽的生物資源，在醫藥、獸藥、飼料添加劑、食品保鮮劑的研制與開發方面具有廣闊的應用潛力，并為篩選活性更理想的高效抗菌肽分子及其基因工程制備，最終實現抗菌肽的產業化廉價生產尋求理論和技術路線具有重要意義。

附圖說明