[發明專利]一種快速獲得辣椒轉基因植株的方法

無效

• 申請號: 201110231054.5
• 申請日: 2011-08-12
• 公開（公告）號: CN102286526A
• 公開（公告）日: 2011-12-21
• 發明（設計）人: 刁衛平;王述彬;劉金兵;潘寶貴;戈偉
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀昌

技術領域

本發明涉及生物技術領域中轉基因植株的獲取方法，尤其涉及一種通過農桿菌侵染辣椒未成熟胚快速獲得轉基因植株的方法。

背景技術

轉基因技術是利用重組DNA、細胞組織培養或種質系統轉化等技術，將外源基因導入植物細胞或組織，使之定向重組遺傳物質，改良植物性狀，培育優質高產作物新品種。自1983年首例轉基因植株誕生，天然植物基因工程開始在人工控制下定向改良植物的遺傳性狀。與常規育種方法相比，它具有以下一些特點：1）不受親緣關系的限制，可實現動物、植物和微生物間遺傳物質的交流，從而充分利用自然界存在的各種遺傳資源；2）有效地打破有利基因和不利基因的連鎖，充分利用有用基因；3）加快育種進程，縮短育種年限。

自第一例轉基因煙草問世以來，植物轉基因研究和應用發展迅速。到1997年為止，全世界轉基因植物涉及到至少35科的200多個種。目前，植株轉基因已成為植物分子生物學研究的強有力的實驗手段；更是基因克隆、功能基因組研究必不可少的實驗工具。近年來，遺傳轉化方法不斷創新，已發表的植物轉基因操作體系有近10種，以轉化系統的原理大致可分為三類：1）農桿菌介導的基因轉移；2）以原生質體、細胞或組織為受體的直接轉移，如電激、微注射、PEG介導法；3）種質系統的基因轉移，如利用子房注射、種胚、體細胞胚及花粉。目前應用最多的是根癌農桿菌介導的轉基因方法，迄今所獲得的200多種轉基因植物中，80%以上是利用該方法獲得的。截至1999年，至少30個國家進行了總計3萬次以上的轉基因作物的田間試驗，改良的經濟性狀有10多個；已有大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、馬鈴薯、煙草、西葫蘆和蕃木瓜等9種作物的轉基因品種投入了商業化生產，取得了良好的社會效益和經濟效益。

辣椒為茄科辣椒屬蔬菜作物，是我國栽培面積最大的蔬菜作物之一。自從首次開展辣椒組織培養工作以來，國內外相繼出現采用不同的辣椒外植體，如子葉、莖尖、莖段、葉片、下胚軸、子葉柄、花藥及其原生質體等進行組織培養的報道。但辣椒組織培養具有很強的基因型特異性，再生效率不理想，在多數試驗中植株的再生周期長或分化頻率低，其不定芽的生長能力較差，有的甚至停留在芽誘導階段而不能進一步生長，這在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究進展。目前，關于辣椒轉基因工作研究主要集中遺傳轉化體系的建立上，但遺傳轉化過程仍存在一些主要問題限制了辣椒轉基因技術在實際育種中的應用，如：培養周期長、植株再生困難和遺傳轉化率低等。因此，如何建立成熟的遺傳轉化體系、提高遺傳轉化率是辣椒轉基因工作中急需解決的一個難題。

發明內容

技術問題??本發明的目的是提供一種通過農桿菌侵染辣椒未成熟胚快速獲得轉基因植株的方法。該方法可用于新基因功能的驗證以及優良轉基因育種材料的獲得，也為其他作物的轉基因研究提供參考。

技術方案??本發明提供了一種通過農桿菌侵染辣椒未成熟胚快速獲得轉基因植株的方法。其過程是對辣椒未成熟胚先進行農桿菌侵染，再進行培養，然后對獲得的再生植株進行PCR鑒定，在短期內獲得轉基因植株。具體步驟如下：

1）取樣：在果實采摘期晴天從健壯植株上取自然成熟的紅果（授粉后40~50天）。

2）農桿菌活化和侵染：將含有目的基因（掌葉半夏凝集素基因PPA，基因全長777bp）的農桿菌LBA4404接種于含有45mg/L卡那霉素及50mg/L利福平的YEB的固體培養基上，27℃暗培養2d后，挑單菌落接種至含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液體培養基中，27℃，250rpm振蕩培養至OD₆₀₀值為0.4~06，將菌液轉入50mL離心管中，4000rpm離心菌液后，用等體積的無菌水懸浮菌液后備用。取1）中果實的種子，用解剖刀將其一分為二，隨后取出未成熟胚轉移至已準備好的農桿菌菌液中，浸沒5分鐘。

3）再生培養基（R培養基）和篩選培養基（S培養基）制備：R和S培養基所用基本培養基為MS培養基，所用碳源為蔗糖，凝固劑為瓊脂。R培養基的組成成分為MS+2mg/L?6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂，S培養基的組成成分為MS+2mg/L?6-BA+3%蔗糖+0.8%瓊脂+60mg/L卡那霉素。

4）未成熟胚接種和培養：將2）中侵染的未成熟胚在滅菌濾紙上瀝干菌液后，置于3）中R培養基上培養先在27℃黑暗條件下培養3天后用無菌水沖洗數次外植體，轉移到篩選培養基上，黑暗培養1周，后于光照度2000lx、光照時間12h、室溫27℃下繼續培養，每三角瓶放30個未成熟胚。