[發(fā)明專利]辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體分離純化及愈傷組織形成的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110230979.8
• 申請(qǐng)日: 2011-08-12
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102388803A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王述彬;刁衛(wèi)平;劉金兵;潘寶貴;戈偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)科學(xué)領(lǐng)域，是一種利用辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料進(jìn)行原生質(zhì)體分離純化及愈傷組織形成的方法，涉及原生質(zhì)體來(lái)源、分離、純化及原生質(zhì)體培養(yǎng)和愈傷組織形成方法。

背景技術(shù)

原生質(zhì)體是指采用機(jī)械或酶解方法去掉細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞。由于沒(méi)有細(xì)胞壁，原生質(zhì)體在作物育種實(shí)踐和遺傳育種理論研究中均具有重要意義。在育種實(shí)踐中，原生質(zhì)體培養(yǎng)成功為開(kāi)展體細(xì)胞雜交奠定了基礎(chǔ)，可以通過(guò)不同類型的原生質(zhì)體融合克服傳統(tǒng)育種方法所面臨的生殖障礙，創(chuàng)造新的種質(zhì)材料，并且可以實(shí)現(xiàn)不同材料的核質(zhì)基因重組。另外，由于原生質(zhì)體在培養(yǎng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生體細(xì)胞無(wú)性系變異，可以從中選出具有優(yōu)良性狀的變異體，可成為農(nóng)作物改良的重要遺傳資源。在遺傳育種理論研究中，原生質(zhì)體可以作為遺傳轉(zhuǎn)化的受體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因研究。此外，原生質(zhì)體還可以為細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、病毒學(xué)等學(xué)科的基礎(chǔ)理論研究提供了理想的實(shí)驗(yàn)體系。

植物雄性不育是植物有性繁殖過(guò)程中不能產(chǎn)生正常可育雄性配體的遺傳現(xiàn)象。按基因型可將雄性不育分為細(xì)胞核控制的雄性不育（GMS）、細(xì)胞質(zhì)控制的雄性不育（CMS）和細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)共同控制的雄性不育（G-CMS）。細(xì)胞質(zhì)雄性不育是植物雜種優(yōu)勢(shì)利用的一條十分重要的途徑，目前，雜交種的應(yīng)用已成為很多作物獲得豐產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和優(yōu)質(zhì)的一項(xiàng)重要措施，而利用細(xì)胞質(zhì)雄性不育系進(jìn)行雜交種生產(chǎn)，具有省去人工去雄、降低成本、提高種子純度和保證種子質(zhì)量等優(yōu)點(diǎn)。然而，當(dāng)前生產(chǎn)上利用CMS進(jìn)行雜種優(yōu)勢(shì)育種中主要存在的問(wèn)題是缺乏優(yōu)良的CMS系。由于CMS性狀為母性遺傳，通過(guò)有性雜交再回交的方法轉(zhuǎn)移該性狀往往需要6~10年的時(shí)間，這無(wú)疑限制了CMS系的選育進(jìn)程。而利用原生質(zhì)體融合技術(shù)可以快速實(shí)現(xiàn)胞質(zhì)基因的轉(zhuǎn)移，獲得更多基因型的雜種，進(jìn)而縮短CMS性狀轉(zhuǎn)育時(shí)間。

建立穩(wěn)定高效的原生質(zhì)體提取體系，是進(jìn)行原生質(zhì)體基礎(chǔ)理論研究和原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合的關(guān)鍵。在植物原生質(zhì)體分離和培養(yǎng)中，所分離的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力以及進(jìn)一步發(fā)育，與分離材料來(lái)源、酶解液組成成分、酶解方法與條件、收集與純化方法、培養(yǎng)基類型和培養(yǎng)等因素有密切關(guān)系。不同的植物，其細(xì)胞壁具有一定的差異性。即使是同一種植物或品種，其不同部位的細(xì)胞壁也不相同。而在原生質(zhì)體進(jìn)一步發(fā)育過(guò)程中，培養(yǎng)基種類和培養(yǎng)方式對(duì)原生質(zhì)體再生能否取得成功起著至關(guān)重要的作用。因此，探索一條適于分離及培養(yǎng)同一類型，特別是同一種植物的原生質(zhì)體的方法尤為重要。

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發(fā)明內(nèi)容

解決的技術(shù)問(wèn)題：本發(fā)明的目的是提供一種辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體的分離純化及愈傷組織形成的方法，有效地分離純化辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體，制備原生質(zhì)體懸浮液，并進(jìn)行原生質(zhì)體離體培養(yǎng)獲得愈傷組織。該方法可用于辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體分離純化及培養(yǎng)，并進(jìn)一步用于原生質(zhì)體融合獲得新型細(xì)胞質(zhì)雄性不育系等辣椒新種質(zhì)，也為其他作物的原生質(zhì)體分離、純化、原生質(zhì)體培養(yǎng)融合及創(chuàng)制新雄性不育系新種質(zhì)提供參考。

技術(shù)方案：本發(fā)明的目的是提供一種辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體的分離純化及愈傷組織形成的方法。具體步驟如下：

1）無(wú)菌苗準(zhǔn)備??利用辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A（圖2-A）相對(duì)應(yīng)保持系21B的花粉對(duì)不育系進(jìn)行授粉，50天后采收自然成熟果實(shí)。在超凈工作臺(tái)上，用75%vt酒精對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，將果實(shí)剖開(kāi)取成熟種子接種到1/2MS固體培養(yǎng)基上，分別置于黑暗處及光照下萌芽和生長(zhǎng)。培養(yǎng)溫度（26±1）℃；光照強(qiáng)度2000~2500?lx，光照時(shí)間16h﹒d^-1。取培養(yǎng)30~40天無(wú)菌苗真葉作游離葉肉原生質(zhì)體的材料。