[發(fā)明專利]辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體分離純化及愈傷組織形成的方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201110230979.8
• 申請(qǐng)日: 2011-08-12
• 公開（公告）號(hào): CN102388803A
• 公開（公告）日: 2012-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王述彬;刁衛(wèi)平;劉金兵;潘寶貴;戈偉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 李紀(jì)昌

1.辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系原生質(zhì)體分離純化及愈傷組織形成方法，其特征在于包含以下步驟：

1）無菌苗準(zhǔn)備：利用辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系相對(duì)應(yīng)保持系的花粉對(duì)不育系進(jìn)行授粉，50天后采收自然成熟果實(shí)；在超凈工作臺(tái)上，用75%vt酒精對(duì)果實(shí)表面進(jìn)行消毒，將果實(shí)剖開取成熟種子接種到1/2MS固體培養(yǎng)基上生長，取培養(yǎng)30~40天健壯無菌苗的真葉作游離葉肉原生質(zhì)體的材料；

2）原生質(zhì)體分離和純化：取無菌苗真葉1g，將其切成1~2mm寬的細(xì)條，置于盛有10mL酶解液的50mL離心管中，封口膜封口，在28℃黑暗條件下放置回旋搖床上酶解；酶解液組成為：含9%wt甘露醇的CPW9+0.5%~1%纖維素酶(w/v)+0.25%~0.5%果膠酶(w/v)+0.1%~0.2%離析酶(w/v)；酶解2~6小時(shí)，將酶解后的混合物用300目無菌尼龍網(wǎng)過濾，濾液在50mL離心管中以500~1000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心3~8min，去上清液，用CPW9溶液懸浮底部沉淀的原生質(zhì)體，洗滌離心2次；

3）原生質(zhì)體懸浮培養(yǎng)：以KM₈P培養(yǎng)基懸浮、洗滌2）中原生質(zhì)體，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體產(chǎn)量，0.01%FDA檢驗(yàn)原生質(zhì)體活力；然后用含有植物激素0.5~2.0mg/L?6-BA、0.5~2.0mg/L?2,4-D和0.5~2.0mg/L?KT的KM₈P培養(yǎng)液懸浮原生質(zhì)體1次，稀釋成密度約10⁵個(gè)/mL原生質(zhì)體進(jìn)行液體淺層培養(yǎng)；

4）愈傷組織形成：前3周進(jìn)行暗培養(yǎng)，每隔1周添加1mL步驟3）所用的含有不同激素的KM₈P培養(yǎng)基，3周后將培養(yǎng)物于漫射光下進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的愈傷組織時(shí)，將其轉(zhuǎn)移至擴(kuò)增培養(yǎng)基弱射光下培養(yǎng)。