[發明專利]一種刺參致病菌的分離和鑒定方法

無效

• 申請號: 201110230345.2
• 申請日: 2011-08-11
• 公開（公告）號: CN102296038A
• 公開（公告）日: 2011-12-28
• 發明（設計）人: 金禮吉;譚德猛;徐永平;李曉宇
• 申請（專利權）人: 大連理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/01
• 代理公司: 大連理工大學專利中心 21200
• 代理人: 梅洪玉

技術領域

本發明涉及一種刺參致病菌分離和鑒定的方法，屬微生物技術領域。

背景技術

由于刺參養殖的過速發展和不規范運作造成了病害問題日趨突出，出現了多種明顯病癥和大規模死亡現象，其中，越冬保苗期和養成期出現的“腐皮綜合征”是目前刺參養殖中危害最為嚴重的疾病。給廣大刺參養殖業者造成了慘重的經濟損失，也嚴重制約了該產業的持續穩定發展。為保證刺參養殖業健康發展，積極開展“腐皮綜合征”流行病學及病原學研究是對疾病進行綜合防治必不可少的基礎性工作。

“腐皮綜合征”是當前刺參養殖中最常見、危害最為嚴重的疾病，該病發生率可達80％，遍及各養殖區域；傳染性強，許多養殖單位的死亡率高達90％以上。越冬保苗期幼參和養成期海參均可被感染發病，每年的12～3月份養殖水體溫度較低時(8℃以下)為發病高峰，在溫度較高的夏秋季節也有發生。主要癥狀從初期感染的口部腫脹、吐腸、收縮僵直，到后期感染的體表大面積潰瘍，最后導致刺參死亡。病原排查發現該病主要是由細菌引起的。

發明內容

本發明提供了一種刺參致病菌的分離和鑒定方法，分離鑒定細菌快速、準確、污染率低、純度高、菌株變異極小，保持了病原菌野生型的特性。過程簡單、成本低，可大量獲得刺參致病菌，以滿足刺參疾病的早期診斷、預防和治療。

本發明的技術方案如下：

A、標樣選擇：選取刺參腐皮組織，在發病處切取1cm×1cm×1cm組織樣品；

B、組織樣品消毒：將組織樣品經用75％酒精消毒60-90秒后，用滅菌海水沖洗，再用無菌PBS沖洗2-4次，組織勻漿，劃線于固體瓊脂培養基；

C、細菌的獲得：將培養皿上長出的菌落再次采用平板劃線分離法進行分離，24-28℃培養箱中培養48-72h后觀察，根據菌落形態、顏色細菌培養性狀，挑選單菌落，然后將細菌純培養保存；

D、刺參腐皮綜合癥致病菌的篩選：將獲得的純培養細菌接種到TCBS選擇性培養基上，24-28℃培養箱中培養48-72h后觀察，篩選半透明、淡黃色的單個菌落；

E、刺參回接感染動物實驗驗證篩選菌落的致病性，分別通過浸泡和體腔注射實驗來觀察細菌致病性；

F、掃描電鏡觀察致病菌的形態結構；

G、通過16s?rDNA?PCR分子生物學方法對致病性單菌落進行鑒定。

附圖說明

圖1是患病刺參圖。

圖2是TCBS培養皿上的單菌落圖。

圖3是單個細菌掃描電鏡圖。

圖4是病原菌分子生物學鑒定的系統進化樹圖。

具體實施方式

實施例1、病灶處優勢菌的分離純化

取患有腐皮綜合癥的刺參樣品(見圖1)于超凈工作臺中切取1cm×1cm×1cm大小的組織塊，放于5mL無菌離心管中，用消毒過的眼科剪刀勻漿制成菌懸液。劃線于固體瓊脂培養基，24-28℃培養箱中培養48-72后，將培養皿上長出的菌落再次采用特異性TCBS平板劃線分離法進行分離，24-28℃培養箱中培養48-72后觀察，根據菌落形態、顏色細菌培養性狀，挑選單菌落，然后將細菌純培養保存。

結果：菌落呈煎蛋形狀，扁平，直徑約為3～5mm，表面凸起，為玉米黃色，不透明，無氣味，不易挑起菌體，菌落光滑且有粘性。(見圖1)

實施例2、菌種保藏

將上述方法制得的純病原菌培養于平板上的單菌落直接接種于2216E固體斜面上，放置于培養箱中28℃下培養24h，然后于4℃的冰箱中保存；

長期保藏：將菌體放入2216E液體培養基中培養，培養約5～6個小時，菌體濃度達到對數期生長期OD₆₀₀＝0.2時，加入甘油，將甘油體積濃度調整為30～50％左右，-80℃冰箱保存即可。

實施例3、致病菌的人工回接感染實驗

(1)實驗前的準備

將容積約8000mL的塑料盆用洗滌劑清洗后用75％酒精擦拭消毒，待酒精揮發后用過濾滅菌PBS沖洗三遍。向每只盆中分別注入5000mL海水，并用充氣閥通氣，海水溫度維持在18～25℃。

(2)刺參的前處理

將從養殖場取回的刺參先在實驗室環境中用過濾滅菌海水馴養7天，挑選大小相近，健康的個體，用滅菌PBS沖洗2次，每個盆中投放10頭。

(3)菌懸液的制備

將分離到優勢菌株劃平板，28℃下培養48h，用過濾滅菌PBS將菌落沖洗下制成菌懸液約20mL。取1mL菌懸液，梯度稀釋后用分光光度計計數。

(4)人工回接感染實驗