[發明專利]一種快速有效地用沃爾巴克氏體（Wolbachia）轉染蚊子的方法

有效

• 申請號: 201110230149.5
• 申請日: 2011-08-11
• 公開（公告）號: CN102349473A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發明（設計）人: 奚志勇;朱儉
• 申請（專利權）人: 廣州沃巴克生物科技有限公司
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;莫瑤江

技術領域：

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種快速有效地用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉染蚊子的方法。?

背景技術：

沃爾巴克氏體(Wolbachia)是廣泛分布于節肢動物體內的共生微生物，它可能是昆蟲共生微生物中最為豐富的類群。它分布于鞘翅目、雙翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鱗翅目等昆蟲種類中。它以垂直傳播作為其在宿主世代間傳遞的基本模式。它穩定地存在于宿主的生殖細胞內，通過卵細胞傳遞給宿主子代，并可通過多種方式如細胞質不親和、雌性化和殺雄性等調控宿主的生殖活動。通過這些調控作用促進其在宿主種群內廣泛傳播。?

在沃爾巴克氏體(Wolbachia)引起的宿主生殖行為改變中，細胞質不親和(Cytoplasmic?Incompatibility，CI)是最常見的一種類型。它表現為當被沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染的雄蚊與未感染雌蚊或感染不同種類Wolbachia的雌雄蚊交配時，精子和卵子結合后胚胎無法發育。沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胞質不親和的特性可導致Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同種Wolbachia的蚊群進行種群壓制和種群替代。它的應用對蚊媒病防治具有巨大的價值。?

它的具體應用依賴于在病媒蚊群中人工引入沃爾巴克氏體(Wolbachia)感染。一些醫學上重要的傳播疾病蚊種如按蚊(傳播瘧疾)和伊蚊(傳播登革)天然都不感染沃爾巴克氏體(Wolbachia)。所以建立人工用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉染蚊子的方法顯得十分重要。目前，主要采用胚胎注射的方法轉染蚊子。此方法大致過程為：獲取沃爾巴克氏體?(Wolbachia)，胚胎注射和轉染成功蚊株的篩選。現階段，有二種方法獲取沃爾巴克氏體(Wolbachia)：一種是先采用人工強制蚊子或果蠅產卵的方法收集含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎，再從中直接抽取胞漿；另一種是先從含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)組織中提取沃爾巴克氏體(Wolbachia)，把它轉入細胞內，讓它在細胞內生長一段時間(1-2年)后，再提取它用于轉染蚊子。對于第一種方法，沃爾巴克氏體(Wolbachia)的獲取依賴于人工強制產卵的方法收集的含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎，而人工強制產卵的方法可控性很差。大多數情況下，不能有效地在需要的時間內(胚胎注射需在蚊卵不超過排出后1.5小時左右完成注射，以便沃爾巴克氏體進入生殖細胞；超過排出后1.5小時的卵一般不能用于胚胎注射)獲取用于抽取沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎。所以，大量時間和精力會消耗在規定時間人工強制產卵的方法獲取含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的胚胎上。而第二種耗時太長，不利于快速建立沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉染的蚊株。?

并且目前，轉染成功蚊株的篩選一般是在原代(G0)，即胚胎注射后的蚊卵孵化并培育成的母成蟲中進行篩選轉染成功的陽性蚊株。但是這種方法是不妥的，這是因為理論上，在原代(G0)中的陽性并不能代表轉染成功，同時，此方法丟棄了原代(G0)中陰性株，這將會損失大量的珍貴原代(G0)，因為有些陽性株就存在于這些被丟棄的陰性原代(G0)的子代(G1)中。?

發明內容：

本發明的目的是提供一種快速有效用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉染蚊子的方法，利用該方法轉染蚊子，可以快速有效的建立沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉染成功的蚊株。?

本發明首先快速的從含有沃爾巴克氏體的昆蟲的卵巢中分離獲取純化的沃爾巴克氏體?(Wolbachia)，然后再經常規的胚胎注射轉染，獲得原代(G0)的蚊株，在子代(第一代，G1)篩選陽性蚊株，由此篩選獲得的陽性蚊株即為真正轉染成功的蚊株，而不會浪費珍貴的原代(G0)蚊株，從而實現了本發明的目的。?

本發明的快速有效用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉染蚊子的方法，包括沃爾巴克氏體(Wolbachia)的獲取，胚胎注射和轉染成功蚊株的篩選，其特征在于：?

所述的沃爾巴克氏體的獲取，包括以下步驟：?

(1)：昆蟲卵巢的制備：解剖含有沃爾巴克氏體(Wolbachia)的昆蟲，獲得其卵巢，置于SPG緩沖液中；?