[發(fā)明專利]一種快速有效地用沃爾巴克氏體（Wolbachia）轉(zhuǎn)染蚊子的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110230149.5
• 申請日: 2011-08-11
• 公開（公告）號: CN102349473A
• 公開（公告）日: 2012-02-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 奚志勇;朱儉
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州沃巴克生物科技有限公司
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星;莫瑤江

1.一種快速有效用沃爾巴克氏體(Wolbachia)轉(zhuǎn)染蚊子的方法，包括沃爾巴克氏體的獲取，胚胎注射和轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選，其特征在于：

所述的沃爾巴克氏體的獲取，包括以下步驟：

(1)：昆蟲卵巢的制備：解剖含有沃爾巴克氏體的昆蟲，獲得其卵巢，置于SPG緩沖液中；

(2)：將卵巢勻漿，用SPG緩沖液沖洗收集，然后置于離心機(jī)中離心100g～1000g，1min～10min，取上清再離心5000g～15000g，5～20min，去除上清，沉積物再用SPG緩沖液沖懸，再離心100g～1000g，1min～10min，取上清，即得到純化的沃爾巴克氏體，該純化的沃爾巴克氏體即可用于蚊子的胚胎注射；

所述的轉(zhuǎn)染成功蚊株的篩選是將胚胎注射后的蚊卵培育獲得原代母成蟲、獲取的原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代蚊株，從中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，由此篩選獲得的陽性蚊株即為轉(zhuǎn)染成功的蚊株。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的含有沃爾巴克氏體的昆蟲包括天然或人工感染沃爾巴克氏體的昆蟲。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的含有沃爾巴克氏體的昆蟲為天然或人工感染沃爾巴克氏體的蚊子或果蠅。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的沃爾巴克氏體的獲取中步驟(2)為：將卵巢勻漿，用SPG緩沖液沖洗收集，然后置于離心機(jī)中離心，300g，5min，取上清再離心12000g，10min，去除上清，沉積物再用SPG緩沖液沖懸，再離心300g，5min，取上清，即得到純化的沃爾巴克氏體。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的從原代母成蟲與野生型公蚊交配后產(chǎn)生第一代蚊株中篩選含有沃爾巴克氏體的陽性蚊株，其具體方法是：提取第一代蚊株產(chǎn)卵后的母蚊的卵巢，應(yīng)用沃爾巴克氏體特征性基因引物進(jìn)行PCR找到轉(zhuǎn)染成功的蚊株。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的快速有效用沃爾巴克氏體轉(zhuǎn)染蚊子的方法，其特征在于，所述的沃爾巴克氏體特征性基因引物為沃爾巴克氏體表面蛋白基因的通用引物：81F?5′-TGG?TCC?AAT?AAG?TGA?TGA?AGA?AAC和691R?5′-AAA?AAT?TAA?ACG?CTA?CTC?CA。