[發(fā)明專利]一種能夠分泌熒光鐵載體的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201110228969.0
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102911891A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳令新;張衛(wèi)衛(wèi);殷堃;牛宗亮;潘婷;趙君才
• 申請（專利權(quán)）人: 煙臺海上傳奇生物技術(shù)有限公司;中國科學(xué)院煙臺海岸帶研究所
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P1/04;C07B63/00;G01N21/64;C12R1/385
• 代理公司: 沈陽科苑專利商標代理有限公司 21002
• 代理人: 周秀梅;李穎

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物材料在環(huán)境污染物檢測中的應(yīng)用，具體講是一種能夠分泌熒光鐵載體的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

呋喃唑酮又名痢特靈，分子式為C₈H₇N₃O₅，是一種人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物。由于呋喃唑酮具有價格便宜、藥效快等優(yōu)點，常用來預(yù)防和控制霍亂、球蟲病、豬腸炎和火雞黑頭病等因細菌和原生物引起的感染，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中也有一定的應(yīng)用。然而研究表明，呋喃唑酮可使實驗動物發(fā)生基因突變并誘發(fā)癌變。呋喃唑酮在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的殘留導(dǎo)致魚蝦類的慢性中毒，嚴重危及魚類的健康養(yǎng)殖。目前國際上已經(jīng)將呋喃唑酮列為違禁藥物，我國的農(nóng)業(yè)部文件農(nóng)牧發(fā)[2002]1號也規(guī)定動物源性食品中呋喃唑酮的檢出限為不得檢出，并頒布了禁止使用該類獸藥的禁令。目前，呋喃唑酮主要的檢測方法為高效液相色譜。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能夠分泌熒光鐵載體的銅綠假單胞菌及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種能夠分泌熒光鐵載體的銅綠假單胞菌：銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)PA1，該菌株已在在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)登記保藏；保藏日期為2011年04月28日；編號為CGMCC?No.4799。

能夠分泌熒光鐵載體的銅綠假單胞菌的應(yīng)用，利用銅綠假單胞菌分泌的熒光鐵載體檢測呋喃唑酮。

所述銅綠假單胞菌分泌的熒光鐵載體的產(chǎn)生及純化過程為：

1)PA1培養(yǎng)：將銅綠假單胞菌培養(yǎng)在無機鹽加丁二酸培養(yǎng)基中，培養(yǎng)溫度為28～30℃，培養(yǎng)轉(zhuǎn)速180～200rpm/min，培養(yǎng)時間為48-72h；

2)熒光鐵載體的純化：將上述培養(yǎng)物以10,000??13,000rpm的轉(zhuǎn)速下離心5-10min，取上清，將上清液中加入2倍于上清液體積的結(jié)合緩沖液，然后將此混合溶液加入到銅離子螯合色譜柱中進行親和層析，洗脫下組分，即為熒光鐵載體。

所述無機鹽加丁二酸培養(yǎng)基成分為每升水中加入磷酸氫二鉀6.0g，磷酸二氫鉀3.0g，硫酸銨1.0g，七水硫酸鎂0.1g和丁二酸4.0g。

所述結(jié)合緩沖液為0.02M磷酸鈉和1M氯化鈉，pH?7.2。所述的洗脫緩沖液的成分為0.02M磷酸鈉，0.5M氯化鈉，0.05M?EDTA，pH?7.2。

熒光鐵載體的純化過程為：將混入了結(jié)合緩沖液的上清液加入到銅離子螯合色譜柱中，然后加入5-10倍體積的結(jié)合緩沖液進行洗滌，使熒光鐵載體結(jié)合到銅離子螯合的色譜柱上。最后加入2-5倍體積的洗脫緩沖液進行洗脫，即可得到較純的熒光鐵載體。

本發(fā)明提供一種能夠在特定條件下分泌熒光鐵載體的菌株P(guān)A1，該菌株是從煙臺海岸帶水域中分離得到。主要分離方法是將采集到的海水進行濃縮，然后涂布到無機鹽加丁二酸培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48h，挑選具有熒光特性的菌落。該菌落經(jīng)16S?rDNA鑒定為銅綠假單胞菌。銅綠假單胞菌(Pseudomonas?aeruginosa)PA1于2011年04月28日被中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)登記保藏，編號為CGMCC?No.4799。該菌在平板上培養(yǎng)邊緣不齊，扁平濕潤。該菌在特定的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，如上述的無機鹽加丁二酸培養(yǎng)基，能夠分泌黃綠色的熒光色素。

在含有熒光鐵載體的HEPES緩沖體系中加入呋喃唑酮，并混合均勻。通過肉眼在紫外燈下觀察該混合物熒光變化或是通過在熒光光譜儀中測定熒光強度。

本發(fā)明所具有的優(yōu)點：本發(fā)明通過有效地分離銅綠假單胞菌PA1產(chǎn)生的熒光鐵載體，檢測環(huán)境中的呋喃唑酮。細菌培養(yǎng)簡單，分離步驟簡單，反應(yīng)具有特異性高、速度快等優(yōu)點。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例分離的銅綠假單胞菌PA1的16S?rDNA。

圖2為本發(fā)明實施例提供的銅綠假單胞菌PA1分泌的熒光鐵載體在漁藥作用下，肉眼觀察到的熒光的變化。其中B3為含有50ppm的呋喃唑酮，而其他孔為含有50ppm的其他漁藥，包括DDT(A1)、敵百蟲(A2)、磺胺嘧啶(A3)、磺胺多辛(A4)、磺胺噻唑(A5)、磺胺甲基嘧啶(B1)、磺胺二甲基嘧(B2)、呋喃唑酮(B3)、六六六(B4)、多菌靈(B5)、己烯雌酚(C1)、二嗪農(nóng)(C2)、乙基溴硫磷(C3)、甲基溴硫磷(C4)、未加漁藥的對照(C5)。