[發明專利]用于脂肪干細胞的無血清凍存液及脂肪干細胞庫的建立

有效

• 申請號: 201110227449.8
• 申請日: 2011-08-09
• 公開（公告）號: CN102550542A
• 公開（公告）日: 2012-07-11
• 發明（設計）人: 張麗;張炳強;張露億;曹衛
• 申請（專利權）人: 臻景生物技術（上海）有限公司;臻景生物技術（無錫）有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C40B40/02;C40B50/06
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 祝蓮君;雷芳

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地，本發明涉及用于脂肪干細胞的無血清凍存液及脂肪干細胞庫的建立。本發明凍存液克服了傳統血清凍存液的缺陷，且經濟有效，用本發明的凍存液建立的脂肪干細胞庫，脂肪干細胞保存完好，具有很強的分化能力。

背景技術

干細胞(stem?cells，SC)是一類具有自我復制能力的多潛能細胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞。胚胎、嬰兒或成人都具有持久或終身自我更新能力的干細胞，具有產生特異的細胞類型、形成人體組織和器官的潛能。根據發育階段，干細胞分為胚胎干細胞和成體干細胞。胚胎干細胞雖然能分化為多種不同的組織，但在細胞分化調節和倫理上局限性限制了其臨床應用。間充質干細胞是目前備受關注的一類具有多向分化潛能的成體干細胞，間充質干細胞可在體外培養擴增，可分化為成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、神經細胞以及肌肉細胞等多種組織細胞

骨髓干細胞、臍帶干細胞和脂肪干細胞(adipose-derived?stem?cells，ADSCs)近年來研究較多。骨髓干細胞由于不易取材、擴增較慢、對于體弱和老年患者不適用以及倫理等問題，給臨床應用帶來不便。臍帶間充質干細胞與骨髓干細胞相比來源較廣泛，免疫原性低，幾乎無免疫排斥反應。脂肪干細胞是近年來從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細胞，它與骨髓干細胞、臍帶干細胞相比有很多優點，研究發現ADSCs細胞能夠在體外穩定增殖且衰亡率低，同時具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細胞，適宜大規模培養，生長均勻、對機體損傷小等優點，而且其來源廣泛、體內儲備量大、適宜自體移植、安全性能高，脂肪干細胞庫的建立逐漸成為近年來新的研究熱點之一。

由于人脂肪間充質干細胞分離培養周期較長，原代細胞鋪滿的時間約2周以上，達到一定的數量需要3周左右。人脂肪間充質干細胞體外長期培養傳代容易發生自發分化，失去其多向分化的潛能。所以為保證實驗的連續性，必須隨時提供大量的實驗或組織工程用的種子細胞。因此建立一種行之有效的凍存方法是必要的，通過檢測人脂肪間充質干細胞在凍存復蘇后的細胞周期，細胞表型和成脂的多向分化潛能來鑒定凍存方法的可靠性。

目前凍存多采用血清進行凍存，血清是細胞培養中用量最大的天然培養基，其優勢主要體現在：

(1)含有豐富的細胞生長所必須的營養成份，充分支持細胞生長；

(2)血清中的大量蛋白對細胞起到一定的保護作用；

(3)為細胞的體外培養提供了細胞增殖所必需的生長因子和微量元素；

(4)為貼壁依賴細胞提供貼壁因子。

然而凍存液中使用動物血清也存在多種缺點，主要包括：

(1)血清含一些對細胞產生毒性的物質，如多胺氧化酶，能與來自高度繁殖細胞的多胺反應(如精胺、亞精胺)形成有細胞毒性作用的聚精胺；補體、抗體、細菌毒素等都會影響細胞生長，甚至造成細胞死亡；

(2)動物個體不同，血清產地、批號不同，每批質量差異甚大，其成分不能保持一致；

(3)取材中可能帶入支原體、病毒，對細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性；

(4)血清成本高，每500ml血清價格可高達3000-4000元；

(5)血清的活體采集對動物有一定損害。

目前還沒有嚴格意義上的適用于脂肪干細胞和脂肪干細胞建庫的無血清凍存液，因此本領域迫切需要開發新穎有效的且適合脂肪干細胞的無血清凍存液。

發明內容

本發明的目的是提供一種有效的可用于脂肪干細胞的無血清凍存液及其應用，避免含有血清的凍存液在臨床使用中可能存在的風險。

本發明的另一目的是提供一種新型高效的脂肪干細胞庫及其建立方法。

在本發明的第一方面，提供了一種無血清凍存液，所述凍存液包括以下組分：無血清培養基、二甲基亞砜(DMSO)和血清替代組分Knockout^TM?SerumReplacement(KSR)，且所述凍存液不含血清。

在另一優選例中，所述無血清凍存液按體積計，無血清培養基的含量為a，a選自5％-15％(v/v)，DMSO含量為b，b選自8％-20％(v/v)，KSR含量為c，c選自70％-85％(v/v)，且a+b+c≤100％。

在另一優選例中，按體積計，a選自8-12％(v/v)，b選自10-14％(v/v)，c選自75-80％(v/v)。

在另一優選例中，按體積計，a為10％(v/v)，b為12％(v/v)，c為78％(v/v)。