[發明專利]一種輔酶A的制備工藝

有效

• 申請號: 201110225924.8
• 申請日: 2011-08-08
• 公開（公告）號: CN102321708A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 劉盛儒;隗青;孫巖;王增鑫;王基偉;張梅村;遲創成
• 申請（專利權）人: 濟南維爾康生化制藥有限公司
• 主分類號: C12P19/40
• 分類號: C12P19/40;C12R1/13
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術領域

本發明涉及一種輔酶A的制備工藝。

背景技術

輔酶A，Coenzyme?A簡稱CoA，它是由β-巰基乙胺、4’-磷酸泛酸、5’-二磷酸腺苷組成。CoA在生物體內主要作為轉乙酰基的輔酶。CoA是體內乙?；磻妮o酶，對體內糖、脂質及蛋白質的代謝起著重要的作用，如三羧酸循環、肝糖原的積存、乙酰膽堿的合成、膽固醇的降低及血漿脂肪含量的調節等。臨床用于動脈硬化、心肌梗塞、多種肝病包括肝炎、脂肪肝等癥、血小板減少性紫斑、白細胞減少癥、尿毒癥、糖尿病酸中毒、功能性低熱的輔助治療等。輔酶A原料藥為白色或淡黃色粉末，有類似蒜臭味，是體內乙?；磻妮o酶，對糖、脂肪和蛋白質的代謝起重要作用。

輔酶A是通過微生物發酵、酶促合成、大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純、葡聚糖凝膠層析精制而得。目前市場普遍存在微生物發酵單位低(發酵單位在300～400u/ml之間，平均在330u/ml)、發酵液雜質多后續分離純化難度大、最終收率低等缺陷。

發明內容

針對上述現有技術中存在的發酵表達量低、活力單位收率少等缺陷，本發明提供了一種高活力發酵表達的輔酶A的制備工藝，本發明對微生物發酵培養基配比進行了改進，對適合微生物生長的葡萄糖、玉米漿及適合生物酶合成的蛋白胨、無機鹽等進行了優化組合，篩選出了最適的微生物發酵酶促合成反應配比，使得微生物菌量與生物酶促合成達到平衡，輔酶A的生物合成表達最大化。

本發明是通過以下技術方案實現的：

一種輔酶A的制備工藝，包括微生物發酵、酶促合成、大孔樹脂吸附、氧化亞銅提純、葡聚糖凝膠層析和還原沉淀六部分，其中，微生物發酵包括菌種選育、菌種發酵兩個階段；所述菌種發酵階段，所采用的培養基的配方組成如下：葡萄糖：8％～10％；玉米漿：1.3％～1.5％；牛骨或魚蛋白胨：1.5％～1.8％；硫酸鎂：1.0％～1.2％；氯化鈣：0.01％～0.02％，尿素0.8％～1.0％，余量為水，各組分按重量百分比。

優選的，所述養基的配方組成如下：葡萄糖：10％；玉米漿：1.4％，牛骨蛋白胨：1.5％；硫酸鎂：1.0％；氯化鈣：0.01％，尿素0.8％，余量為水。

優選的，所述菌種發酵階段，發酵條件為：溫度30～35℃，空氣流量1∶(0.6～1.0)，時間20～26小時，發酵完成后，檢測pH值、OD值、殘留糖量并鏡檢有無雜菌。

優選的，在所述菌種選育階段，選用產氨短桿菌，理由為：能進行輔酶A酶合成反應的菌種很多，如酵母菌、短桿芽孢桿菌、假單孢菌、產氨短桿菌等；國內外文獻報道表明，產氨短桿菌通過發酵富集菌量然后進行酶促合成輔酶A產量是最高的，因此選用產氨短桿菌。

優選的，在所述酶促合成部分，向酶反應液中分次加入1次、2次或3次前體物質鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉，進一步優選的，向酶反應液中分加入1次前體物質鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉。

優選的，所述前體物質鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣和三磷酸腺苷二鈉按酶反應液的重量百分比添加，添加量分別為0.1％～0.2％鹽酸半胱氨酸、0.07％～0.08％泛酸鈣、0.2％～0.3％三磷酸腺苷二鈉。

優選的，所述酶促合成部分，酶反應溫度30～35℃，空氣流量1∶(0.3～0.6)，時間20～24小時，反應過程中不斷地攪拌；反應后，得反應液，反應液酸化壓濾，得壓濾清液。

本發明的輔酶A的制備工藝具體步驟可以如下：

(一)微生物發酵

輔酶A發酵菌種經發酵培養，溫度30～35℃，空氣流量1∶(0.6～1.0)，時間20～26小時，檢測pH值、OD值、殘留糖量并鏡檢無雜菌。

(二)酶促合成

向酶反應液中逐步加入前體物質鹽酸半胱氨酸、泛酸鈣、三磷酸腺苷二鈉，酶反應溫度30～35℃，空氣流量1∶(0.3～0.6)，時間20～24小時。攪拌得反應液，反應液酸化壓濾，得壓濾清液。

(三)大孔樹脂吸附

壓濾清液上已處理好的CAD型大孔樹脂吸附，低濃度乙醇淋洗除雜質，堿性乙醇液洗脫得到分離液，洗脫液真空濃縮，得濃縮液。

(四)氧化亞銅提純

濃縮液加入鹽酸半胱氨酸，硫酸調節pH，加入氧化亞銅，使輔酶A形成巰醇鹽沉淀，用無鹽水洗滌沉淀，用硫化氫脫除銅，離心后濃縮得濃縮液。

(五)葡聚糖凝膠層析