[發明專利]一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110224449.2
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102321745A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 夏東元
• 申請（專利權）人: 博爾誠（北京）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

技術領域

本發明涉及一種檢測DNA甲基化的方法及試劑盒，尤其是一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法及試劑盒。

背景技術

DNA甲基化是表觀遺傳學(Epigenetics)的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要作用，是目前新的研究熱點之一。

DNA甲基化是最早發現的基因表觀修飾方式之一，存在于所有生物的DNA遺傳物中。DNA甲基化能關閉或啟開某些基因的活性，去甲基化則誘導或鈍化了基因的重新活化和表達。甲基化的主要形式有5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤。原核生物中CCA/TGG和GATC常被甲基化，而真核生物中甲基化僅發生于胞嘧啶。DNA的甲基化是在DNA甲基化轉移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5′端的胞嘧啶轉變為5′甲基胞嘧啶。這種DNA修飾方式并沒有改變基因序列，但是它調控了基因的表達^[1]。脊椎動物基因的甲基化狀態有三種：持續的低甲基化狀態，如管家基因；去甲基化狀態，如發育階段中的一些基因；高度甲基化狀態，如女性的一條失活的X染色體^[2]。

在哺乳動物中，CpG序列在基因組中出現的頻率僅有1％，遠低于基因組中的其它雙核苷酸序列。但在基因組的某些區域中，CpG序列密度很高，可以達均值的5倍以上，成為鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，形成所謂的CpG島^[3]。通常，CpG島大約含有500多個堿基。在哺乳動物基因組中約有4萬個CpG島，而且只有CpG島的胞嘧啶能夠被甲基化^[4]，CpG島通常位于基因的啟動子區或是第一個外顯子區^[5]。健康人基因組中，CpG島中的CpG位點通常是處于非甲基化狀態，而在CpG島外的CpG位點則通常是甲基化的。這種甲基化的形式在細胞分裂的過程中能夠穩定的保留^[6]。當腫瘤發生時，抑癌基因CpG島以外的CpG序列非甲基化程度增加，而CpG島中的CpG則呈高度甲基化狀態，以致于染色體螺旋程度增加及抑癌基因表達的丟失。

甲基化狀態的改變是引起腫瘤的一個重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，從而導致基因組的不穩定和抑癌基因的不表達。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活，則發生癌癥的機率提高^[7]。因此，甲基化的研究，為腫瘤的早期預測、分類、分級及預后評估提供了新的依據。

隨著對甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測方法被開發出來以滿足不同類型研究的要求。這些方法概括起來可分為三類：序列檢測法，甲基化DNA特異性內切酶法和化學法。

Eads等^[8]2000年報道的熒光法利用實時PCR(Real-time?PCR)檢測特定位點甲基化的情況，其過程如下：先用重亞硫酸鹽處理待測DNA片段。設計一個能與待測位點區互補的探針，探針的5′端連接報告熒光，3′端連接淬滅熒光，隨后進行實時定量PCR。如果探針能夠與DNA雜交，則在PCR用引物延伸時，TaqDNA聚合酶5′到3′端的外切酶活性會將探針序列上5′端的報告熒光切下，淬滅熒光不再能對報告熒光進行抑制，使得報告熒光發光，檢測每個循環報告熒光的強度即可得到該位點的甲基化情況及水平；同理，若標記的探針未能與DNA雜交，則引物延伸不能跳過未甲基化位點，報告熒光不被切下，不發光。同樣的方法，也可對引物進行熒光標記，并通過不同標記的組合，檢測多個位點的甲基化水平。高敏感、快速是本方法最顯著的特點，而且可以做多樣本、多基因位點的快速分析。此外其具備可重復、所需樣本量少、不需要電泳分離的特點，可以為臨床標本的分子生物學研究提供可靠的技術支持。

基于上述設計理念，通常采用一條甲基化探針對樣本特異位點進行甲基化檢測，以特定位點甲基化絕對量作為甲基化程度評定的標準。但是在實際臨床應用過程中，由于難以獲得均一的完全病變的臨床樣本，因此在上述實時PCR檢測過程中，不可避免的在病變樣本中摻入了正常樣本的甲基化或非甲基化因素，造成甲基化程度判定的誤差，從而影響了檢測結果的準確性。在這種情況下，上述實時PCR檢測特定位點甲基化的方法就受到了限制。

發明內容

因此，本發明的目的是提供一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法。

本發明的另一個目的是提供一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的試劑盒。