[發明專利]一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201110224449.2
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102321745A
• 公開（公告）日: 2012-01-18
• 發明（設計）人: 夏東元
• 申請（專利權）人: 博爾誠（北京）科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 劉丹妮

1.一種定量檢測DNA特定位點甲基化程度的方法，其特征在于，所述方法包括：

1)針對待測DNA序列設計PCR引物，用于擴增待測DNA；

2)針對1)中擴增得到的PCR產物中的CpG位點富集區設計一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設計的TG探針，用于特異地與PCR產物結合并檢測PCR產物；和

3)采用1)設計的引物和2)設計的探針進行實時定量PCR，檢測待測DNA的甲基化程度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測DNA先經過化學處理；優選地，所述化學處理為重亞硫酸鹽處理。

3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步驟1)設計的PCR引物為兼并引物，其中對應CpG位點處的堿基設計為CG/TG；優選地，所述步驟2)中設計的CG探針和TG探針長度相同，且二者只在CpG位點存在差異，其中CG探針中所有的對應甲基化CpG位點處的堿基都設計為CG，而TG探針中所有的對應非甲基化CpG位點處的堿基都設計為TG。

4.根據權利要求1至3中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟3)可以通過檢測到的雙探針的Cq值，計算待測DNA中特定位點的甲基化程度，并且所述甲基化程度分值(MS)通過下式計算：

??????????????????MS＝100/[1+2^(CqM-CqU)]

其中CqM和CqU分別為CG探針和TG探針檢測的Cq值。

5.根據權利要求1至4中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟2)中設計的TaqMan探針的熒光標記物位于探針的5’端，所述熒光標記物優選選自FAM和HEX；優選地，所述步驟2)中設計的TaqMan探針的3’端與熒光淬滅基團相連，所述淬滅基團優選選自BHQ1。

6.根據權利要求1至5中任一項所述的方法，其特征在于，所述步驟3)中的實時定量PCR為TaqMan法。

7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其特征在于，所述待測DNA可以來源于任何生物樣品；優選地，所述待測DNA選自細胞、組織(包括蠟塊組織)、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便及其他分泌物。

8.一種用于定量檢測DNA特定甲基化程度位點的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括：1)針對待測DNA序列設計的PCR引物，用于擴增待測DNA；和2)針對1)中擴增得到的PCR產物中的CpG位點富集區設計的一對TaqMan探針，其中一條是針對CpG位點完全甲基化的DNA設計的CG探針，另外一條是針對CpG位點完全非甲基化的DNA設計的TG探針，用于特異地與PCR產物結合并檢測PCR產物；優選地，所述試劑盒還包括重亞硫酸鹽，用于對待測DNA預先進行化學處理。

9.根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括的PCR引物為兼并引物，其中對應CpG位點處的堿基設計為CG/TG。

10.根據權利要求8或9所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括的TaqMan探針中，CG探針和TG探針長度相同，且二者只在CpG位點存在差異，其中CG探針中所有的對應甲基化CpG位點處的堿基都設計為CG，而TG探針中所有的對應非甲基化CpG位點處的堿基都設計為TG；優選地，所述TaqMan探針的熒光標記物位于探針的5’端，所述熒光標記物優選選自FAM和HEX；和/或優選地，所述TaqMan探針的3’端與熒光淬滅基團相連，所述淬滅基團優選選自BHQ1。