[發明專利]一種能識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3

有效

• 申請號: 201110223496.5
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102268091A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 戴和平;羅紹祥;陳叢林;張曉華;廖蘭杰;汪亞平
• 申請（專利權）人: 中國科學院水生生物研究所
• 主分類號: C07K16/42
• 分類號: C07K16/42;C12N15/13;G01N33/569;C12P21/08;C12R1/92
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司 42215
• 代理人: 王健

1.一種能識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3，其特征在于，編碼單鏈抗體C1B3基因的DNA序列如下：

GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGCTGGAGTCTGGAGGTGGCCTGGTGCAGCCTGGAGGATCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCGATTTTAGTAGATACTGGATGAGTTGGGTCCGGCAGGCTCCAGGGAAAGGGCTAGAATGGATTGGAGAAATTAATCCAGATAGCAGTACGATAAACTATACGCCATCTCTAAAGGATAAATTCATCATCTCCAGAGACAACGCCAAAAATACGCTGTACCTGCAAATGAGCAAAGTGAGATCTGAGGACACAGCCCTTTATTACTGTGCAAGAGAGACGGGGTACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGAAACAGTCAGTCTTTCCTGTAGGGCCAGCCAGAGTATTTACAAGAACCTACACTGGTATCAACAGAAATCACATCGGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCTGATTCCATCTCTGGGATCCCCTCCAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTACACTCTCAGTATCAACAGTGTGAAGCCCGAAGATGAGGGAATATATTACTGTCTTCAAGGTTACAGCACACCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAGACTGTTGAAAGTTGTTTAGCAAAACCTCATACAGAAAATTCATTTACTAACGTCTGGAAAGACGACAAAACTTTAG

單鏈抗體C1B3的預測氨基酸序列為：

MAEVQLLESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFDFSRYWMSWVRQAPGKGLEWIGEINPDSSTINYTPSLKDKFIISRDNAKNTLYLQMSKVRSEDTALYYCARETGYYFDYWGQGTTLTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPATLSVTPGETVSLSCRASQSIYKNLHWYQQKSHRSPRLLIKYASDSISGIPSRFTGSGSGTDYTLSINSVKPEDEGIYYCLQGYSTPYTFGGGTKLEIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA。

2.實現權利要求1所述的一種能識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3的制備方法，其特征在于，該制備方法包含如下步驟：

（1）從健康小鼠的骨髓干細胞、外周血淋巴細胞和脾臟細胞中提取mRNA；?

（2）將得到的mRNA反轉錄為?cDNA，用對應于重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物，通過PCR技術將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴增；

（3）用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接；組成單鏈抗體基因，然后與具同樣酶切位點的噬菌體表達載體Pcantab?5E連接，電轉移至大腸桿菌E.?coli?NM522中，獲得鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA文庫；

（4）進行10次電轉移，合并10次電轉移得到的cDNA文庫，該cDNA文庫的效價為1.2×10⁹；

（5）從草魚血清中提取IgM，用硫酸銨鹽析法和Protein?A柱層析的方法純化IgM，并將草魚IgM吸附在塑料管壁上；

（6）用吸附在塑料壁上的草魚IgM對步驟（4）中得到的效價為1.2×10⁹的鼠源天然抗體噬菌體展示cDNA抗體文庫進行三輪淘選，得到cDNA抗體文庫的菌液；

（7）將菌液涂抹在氨芐抗性的平板上，37℃培養至長出單菌落；

（8）選取單菌落，用ELISA方法鑒定可特異識別草魚IgM的單鏈抗體陽性克隆株，陽性克隆中OD_450nm值最高的命名為C1B3菌株；?

（8）對C1B3菌株進行DNA測序；

（9）用C1B3菌株誘導表達可溶性單鏈抗體，該單鏈抗體即為本發明的一種識別草魚IgM的單鏈抗體C1B3。