[發明專利]一種利用微衛星引物鑒定草魚的方法

無效

• 申請號: 201110223437.8
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102251048A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 李新輝;楊計平;李捷;譚細暢;王超;李躍飛;賴子尼;吳瑞全;吳茜
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

1.一種利用微衛星技術鑒定草魚的方法，其特征在于所述方法包括如下步驟：

（1）提取魚類DNA（包括草魚及其它28種魚類鰭條基因組DNA），測定其OD值，于-20℃儲存備用；搜索NCBI?dbEST中草魚的ESTs序列，用軟件SSRHutter1.3進行SSR的查找，然后用Primer?Premier5.0進行引物設計并對其進行優化，在29種魚類DNA樣本中進行篩選，篩選到識別草魚的2對特異性微衛星引物；用這些引物在96個不同來源的草魚DNA樣本中進行驗證，微衛星帶譜穩定；

（2）分別將所提的草魚及其它魚類基因組DNA稀釋為40ng/ml；

（3）優化引物的退火溫度，并用這些引物對草魚不同群體內個體的基因組DNA進行PCR擴增，PCR反應體系為20ul：0.5umol/L的引物，0.2?mmol/L的dNTP，2?mmol/L的Mg²⁺，1×PCR反應緩沖液，1U的Taq?DNA聚合酶；使用這些引物時設置的PCR程序參數為：94℃預變性3min,30個循環：94℃變性30s,Ta下退火30s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min；

（4）PCR擴增產物經10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，220V穩壓電泳3小時，然后用0.1%的AgNO3染色1min,?銀染后用2%的NaOH、0.2%無水Na2CO3、0.4%甲醛顯色2min，直至條帶清晰為止，并拍照保存；

（5）在84對微衛星引物中篩選到草魚單態性引物59對，占到所用引物的70%；

（6）用上述單態性引物分別對草魚和其它28種魚類按上述條件進行PCR擴增、電泳，篩選出在這些魚類中沒有任何擴增產物的引物，最終將草魚與其他魚類相分開；

所述2對特異性引物序列如SEQ?ID?NO:1~4所示。