[發明專利]一種利用微衛星引物鑒定草魚的方法

無效

• 申請號: 201110223437.8
• 申請日: 2011-08-05
• 公開（公告）號: CN102251048A
• 公開（公告）日: 2011-11-23
• 發明（設計）人: 李新輝;楊計平;李捷;譚細暢;王超;李躍飛;賴子尼;吳瑞全;吳茜
• 申請（專利權）人: 中國水產科學研究院珠江水產研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛

技術領域

本發明涉及DNA分子標記檢測領域，具體涉及一種利用微衛星引物鑒定草魚的方法。

背景技術

草魚（Ctenopharyngodon?idellus），又名鯇、草鯇、白鯇等，為我國主要淡水養殖魚類之一，分布在全國各大水系。近年來因過度捕撈、大規模興建水利工程、水質污染等影響，使草魚資源量銳減，為了盡快掌握群體結構及其種質資源狀況，從而制定和實施更科學合理的漁業管理政策，有必要對草魚建立一種種的分子識別技術，微衛星標記則成為首選的標記之一，研究表明，在真核生物中大約每隔10-50kb就存在1個微衛星，如在魚類基因組中，微衛星被認為每隔10kb左右就會出現一次（Wright，1993），廣泛分布于編碼區、內含子以及非編碼區中；微衛星DNA的側翼序列較為保守，從而保證了PCR擴增的高效性和穩定性，由于重復單元數目的變化，因此表現出長度多態性（即SSR）,該標記方法尤其表現在對DNA樣品的要求不高，即使樣品DNA有一定程度的降解，利用微衛星分析也能得到較好的結果，非常有利于分析特殊樣品（如化石樣品、乙醇固定的魚苗等），由于其具有上述優點，SSR被廣泛應用于遺傳圖譜的構建、QTL、品種鑒定等領域。

目前，對草魚的鑒別方法主要有3種：（1）形態法：通過對草魚的外部形態特征進行鑒定，如體型、肌節數等，該法簡便、經濟、直觀，對成體草魚都能得到較好的鑒定結果，但是并不能將其應用于仔稚魚的鑒定研究，因為早期發育的仔稚魚經乙醇固定后會脫水、變形、某些色素會有所消失，而且會帶一定的主觀色彩，嚴重制約了形態鑒定的可行性.（2）同工酶法：主要是通過聚丙烯酰胺凝膠或淀粉凝膠電泳進行，如李思發（1990）對長江四大家魚原種的10種同工酶電泳分析表明，其同工酶譜可作為四大家魚種質鑒定標準，但同工酶表達與組織發育時期有關，限制了其在仔稚魚鑒定中的應用，（3）分子標記法：在分子標記方面，RAPD常用于物種鑒定中，如薛國雄等對長江、珠江、黑龍江3?大水系的草魚的RAPD?分析表明，每一水系的草魚特征性基因圖譜可作為種群鑒定的依據，但RAPD標記重復性和穩定性較差，鑒于此，微衛星標記則為最佳的分子標記之一，目前，也有好多學者將其應用于品種鑒定領域，如公開號為CN1370834A的專利申請：“適于豬品種分類的微衛星DNA標記”以及扇貝微衛星標記的篩選及其在物種鑒定中的應用等，關于草魚也有許多微衛星標記的研究，但其目的用于分析草魚的遺傳多樣性而不是用于物種鑒定，所以，利用微衛星引物資源共享，設計和探究一種微衛星技術鑒定草魚的方法顯得尤為重要。

發明內容

本發明的目的在于根據現有技術中存在的不足，提供一種準確的鑒定草魚的微衛星標記方法，可用于草魚早期資源鑒定。

本發明上述目的通過以下技術方案予以實現：

本發明參考已發表的文獻中的79對鯉科魚類微衛星引物，從中篩選出一組（2對引物）能鑒定草魚的特異性微衛星引物。通過二種微衛星的識別，可將其它28種魚類與草魚區別（見附錄）。本發明的草魚微衛星DNA標記主要用于魚類早期資源鑒定中區分草魚、早期資源魚類群落結構分析、江河生態評價等，重復性好，是一種可靠有效的分子標記。

本發明的具體步驟如下：

1）傳統的酚-氯仿法提取草魚及其它魚類基因組DNA（表1）；

2）引物設計與優化，從NCBI?dbEST中搜索草魚的ESTs序列，用軟件SSRHutter1.3進行SSR的查找，然后用Primer?Premier5.0進行引物設計，獲得草魚EST-SSR引物84對，并對這些引物使用溫度梯度PCR儀進行退火溫度的優化；

3）PCR擴增

用上述引物以草魚基因組DNA為模板進行PCR擴增反應，PCR反應體系為20ul：0.5umol/L的引物，0.2?mmol/L的dNTP，2?mmol/L的Mg²⁺，1×PCR反應緩沖液，1U的Taq?DNA聚合酶；用這些引物時設置的PCR程序參數為：94℃預變性3min，30個循環：94℃變性30s，Ta下退火30s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min；

4）PCR產物檢測

PCR擴增產物經10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，220V穩壓電泳3小時，然后用0.1%的AgNO₃染色1min，銀染后用2%的NaOH、0.2%無水Na₂CO₃、0.4%甲醛顯色2min，直至條帶清晰為止；