[發明專利]一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法

無效

• 申請號: 201110223296.X
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102908620A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 李帥偉;廖榮斌
• 申請（專利權）人: 廣州格拉姆生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/395
• 分類號: A61K39/395;A61P1/12
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于獸醫生物制品技術領域，具體涉及一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法。?

背景技術

豬博卡病毒(Porcine?Bocavirus，PBoV)是一種無包膜的單鏈DNA病毒，歸屬于細小病毒科博卡病毒屬。2005年，Allander首次從患呼吸道感染的嬰幼兒中分離得到人的博卡病毒。自此以后，世界各地紛紛在呼吸道，血液，糞便，尿液等處發現博卡病毒。有呼吸道病癥的患者感染博卡病毒的幾率明顯比正常人高。2009年，在瑞典豬群中偶然發現豬群中存在PBoV，2010年我國豬群中也檢測到PBoV。在臨床上博卡病毒主要導致人、牛、豬等動物的下呼吸道感染和腹瀉。而豬Kobu病毒(Porcine?Kokuvirus)為小RNA病毒科成員，不同種屬動物體內檢測的Kobu病毒存在著差異，這類病毒是胃腸炎疾病的主要病原之一，引起幼齡動物(豬、牛、人少數)高發病率和高死亡率，成年動物死亡率較低，但感染率同樣很高，主要癥狀和傳胃流腹極為相似。?

自2010年4月至今，韓國、泰國；我國的廣東、福建、廣西、江西、湖北、河北和山東規模化豬場的仔豬陸續發生嚴重腹瀉：哺乳仔豬多在出生后2-3天發生嘔吐，隨后發生劇烈腹瀉，死亡率較高，有的地區出現腹瀉后死亡率達到100％。而母豬和育肥豬無明顯癥狀。按照流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒感染時的處理措施，基本無顯著效果。臨床解剖主要癥狀為胃腸道的嚴重出血。對嚴重腹瀉仔豬采集的樣本分析發現，流行性腹瀉、傳染性胃腸炎和輪狀病毒檢測陽性率較低，陽性率不足5％，而豬博卡病毒(porcine?bocavirus，PBoV)和Kobu病毒檢測陽性率達到86.6％。由此可見，PBoV和Kobu病毒是這次仔豬腹瀉的罪魁禍首。但到目前為止，由于對該兩種病毒的認識還不夠深入，尚無有效的疫苗和防治措施，因此研制抗PBoV和Kobu病毒藥物迫在眉睫。?

目前，卵黃抗體已經廣泛運用于雞、鴨、鵝、犢牛、仔豬和羔羊等動物疾病的緊急治療和預防中，如雞傳染性法氏囊、雞新城疫、雞白痢、鴨病毒性肝炎、小鵝瘟、豬輪狀病毒、犬瘟熱、犬細小病毒病、羔羊輪狀病毒腹瀉、仔豬輪狀病毒腹瀉等。卵黃抗體是一種高產、優質的多克隆抗體，制備簡單，容易提取，可以高效特異的對病毒性/細菌性疾病進行治療；而且雞大規模工業化飼養成本低，經濟方便。同時使用卵黃抗體進行疾病治療可以減少抗生素的使用，減少耐藥株的出現，從而降低疫病控制成本。因此，卵黃抗體在生物制品的開發和疾病的防治方面具有廣闊的前景。且迄今為止，運用卵黃抗體治療豬呼吸道綜合癥的研究尚未有報到。?

發明內容

本發明的目的是提供一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液及其制備方法，用于防治仔豬腹瀉，在降低防疫成本和耐藥性菌株產生的前提下，有效的提高動物的生產性能和疫病防治效果，且不會對人產生食源性污染和藥物殘留。?

本發明的目的是通過以下技術方案來實現：?

一種治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液，以實驗分離當前流行的毒株為基礎，將分離的豬博卡病毒和豬Kobu病毒滅活后制備成二聯滅活疫苗免疫非免疫母雞，免疫后收集免疫母雞所產雞蛋，從蛋黃中提取出卵黃抗體將其制備成安全、高效的卵黃抗體注射液。?

上述的治療仔豬腹瀉的卵黃抗體注射液的制備方法，包括以下步驟：?

1)分離當前流行的PBoV和Kobu病毒，分別用豬腎原代細胞分離培養PBoV，用Vero細胞培養Kobu病毒，測定病毒滴度后制備成二聯滅活疫苗，制備的疫苗中PBoV和Kobu病毒的TCID₅₀不低于10⁷/ml；?

2)利用制備的二聯滅活疫苗免疫非免產蛋母雞，免疫程序如下：與產蛋前30天首次免疫，免疫劑量為2ml/羽，首次免疫后2、4分別進行兩次加強免疫，免疫劑量為3ml/羽，此后每隔2月全群免疫一次，免疫劑量為2ml/羽，以誘導?母雞持續性的產生抗PBoV和Kobu病毒的抗體；?

3)第三次免疫后14天收集雞蛋，運用75％乙醇消毒蛋殼，在無菌條件下收集卵黃，運用等量磷酸鹽緩沖液(0.1M?PBS，PH7.2)后置組織勻漿器中，5000轉/分勻漿1分鐘，加入乳酸至PH為4.0，2～8℃攪拌過夜，置-80℃冷凍后解凍，并重復冷凍一次，然后8000轉/分離心10分鐘，收集上清，按照1∶1的比例加入飽和硫酸銨，2～8℃攪拌2消失，后2～8℃靜置過夜，8000轉/分離心10分鐘收集沉淀，加入0.1M?PBS溶解后除去硫酸銨；?

4)運用微量中和實驗測定PBoV和Kobu病毒的中和抗體效價；?