[發明專利]一種豬用免疫增強劑IL-12B(P40)及其制備方法

無效

• 申請號: 201110223294.0
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102908613A
• 公開（公告）日: 2013-02-06
• 發明（設計）人: 李帥偉;于賓賓
• 申請（專利權）人: 廣州格拉姆生物科技有限公司
• 主分類號: A61K38/20
• 分類號: A61K38/20;A61K39/187;A61K39/39;C12N15/62;A61P37/04;A61P31/14
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技術領域

本發明涉及基因重組技術領域，尤其涉及一種豬用免疫增強劑IL-12B(P40)及其制備方法。

背景技術

白介素12(IL-12)，又名細胞毒淋巴細胞成熟因子(cytotoxic?lymphocyte?maturation?factor，CLMF)，或稱細胞刺激因子(natural?killer?cell?stimulation?factor，NKSF)。它是一種由分子量為40kDa和35kDa的兩個亞基組成的異源二聚體的細胞因子，主要由樹突狀細胞(DC)、巨噬細胞(MФ)、B淋巴細胞以及其他一些抗原提呈細胞(APC)產生，它能促進分化的CD4+T輔助細胞1(Th1)的增殖，誘導NK細胞和T細胞產生細胞因子(主要是γ干擾素)，提高NK細胞的細胞毒性，促進細胞毒性T細胞的形成等等。IL-12在機體早期的非特異性免疫和隨后的抗原特異性的適應性免疫過程均扮演了極重要的角色。

發明內容

本發明的目的是提供一種豬用免疫增強劑IL-12B(P40)及其制備方法，應用于豬病原體(如豬瘟病毒、豬藍耳病病毒等)感染的預防及治療。

本發明的目的是通過以下技術方案來實現：

一種豬用免疫增強劑IL-12B(P40)，是一種基因重組蛋白，該蛋白含有豬IL-12的P40亞基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。

一種豬用免疫增強劑IL-12B(P40)的制備方法，包括以下步驟：

1)以IL-12B(P40)特異性的上下游引物，通過RT-PCR合成包含EcoRI和XhoI兩個酶切位點的IL-12B(P40)cDNA，經過純化酶切，重組至原核表達載體pGEX-6p-1；

2)該重組質粒轉化大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)，經IPTG誘導的表達產物為GST-IL-12B(P40)融合蛋白；

3)將純化的GST-IL-12B(P40)融合蛋白與化學合成的豬瘟病毒T細胞表位E290多肽(KHKVRNEVMVHWFDD)混勻，免疫豬后，通過淋巴細胞增殖實驗檢測機體的T細胞免疫反應。。

本發明的有益效果為：重組融合蛋白可作為一種免疫增強劑，與豬病原體(如豬瘟病毒、豬藍耳病病毒等)的一些T細胞表位(如豬瘟病毒T細胞表位E290多肽：KHKVRNEVMVHWFDD)聯合免疫動物，增強機體的細胞免疫水平，應用于豬病的預防及治療。

具體實施方式

本發明實施例所述的一種豬用免疫增強劑IL-12B(P40)，是一種基因重組蛋白，該蛋白含有豬IL-12的P40亞基[IL-12B(P40)]的主要氨基酸序列。

實施例1：IL-12B(P40)基因克隆到原核表達載體pGEX-6p-1

1、設計IL-12B(P40)基因引物

參考豬源IL-12B(P40)基因序列(GenBank號：NM_214013)設計擴增IL-12B(P40)基因引物如下，引入酶切位點為EcoRI和Xho?I(用斜體表示)：

F-E：GCATGCACCTTCAGCAGCTG，

R-X：GCCTAATTGCAGGACACAGATG。

2、提取豬外周血單核淋巴細胞(PBMC)的總RNA

根據invitrogen公司的RNA提取試劑盒，從豬PBMC中提取總RNA。

3、IL-12B(P40)基因的反轉錄及PCR

根據invitrogen公司的RT-PCR試劑盒進行反轉錄，獲得IL-12B(P40)-mRNA的cDNA。然后根據上述引物為PCR擴增IL-12B(P40)基因。

PCR反應條件如下：94℃4分鐘；94℃40秒，55℃40秒，72℃75秒；共30循環；72℃10分鐘。結果得PCR產物約為975bp的目的片段。

4、陽性重組質粒pGEX-6p-1-IL-12B(P40)的獲取

1％瓊脂糖凝膠電泳后，回收目的條帶，按下列體系用EcoR?I和Xho?I雙酶切回收PCR產物及載體pGEX-6p-1質粒：

37℃酶切反應2小時后，電泳回收目的條帶，按下列體系連接載體與PCR片段：

16℃反應5小時后，轉化感受態大腸桿菌DH5α，挑取陽性單克隆進行基因測序，將測序表明含有IL-12B(P40)基因的載體命名為pGEX-6p-1-IL-12B(P40)。

實施例2：IL-12B(P40)蛋白的誘導表達及純化