[發(fā)明專利]變性梯度凝膠電泳技術檢測黃酒麥曲中細菌群落結(jié)構(gòu)的方法

無效

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• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102277432A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發(fā)明（設計）人: 陸健;張中華;管政兵;陳亮亮
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N27/447
• 代理公司: 北京匯信合知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測黃酒麥曲細菌群落結(jié)構(gòu)的方法，尤其是一種利用PCR-DGGE(Denaturing?gradient?gel?electrophoresis，變性梯度凝膠電泳)技術檢測黃酒麥曲細菌群落結(jié)構(gòu)，本發(fā)明屬于微生物生態(tài)技術領域。

背景技術

變性梯度凝膠電泳技術是一種檢測DNA突變的電泳技術。Muzyer等在微生物生態(tài)研究中首次采用了該技術，并且證實了該技術在研究微生物多樣性方面具有明顯的優(yōu)越性。DGGE能夠分離長度相同但是堿基組成不相同的DNA片段混合物，變性劑——尿素和去離子甲酰胺添加到普通的丙烯酰胺凝膠中從而形成從低到高的線性梯度。在一定的溫度條件下，不同堿基組成的DNA片段解鏈溫度是不相同的，從而會造成不同的電泳遷移率，故將這些DNA片段在添加變性劑的凝膠中進行電泳時，會遷移到凝膠的不同位置，最終將長度相同但堿基組成不同的DNA片段分離開來。將PCR和DGGE聯(lián)合起來，在適宜的變性梯度條件下能夠分辨出一個堿基對的差異，分辨率高。染色后的凝膠圖譜通過條帶數(shù)的多少在一定程度上可以反應樣品中微生物組成的差異，條帶的亮度在一定程度上可以反應出樣品中微生物的多少。

傳統(tǒng)的研究微生物多樣性的方法主要依賴于培養(yǎng)法，即通過菌株的分離純化、形態(tài)和顯微鏡觀察、生理生化特征的比較后進行菌株的分類鑒定，該方法步驟復雜、工作量大，而且對于生理生化特征相似的菌株難以進行正確的鑒定和分類。黃酒是中國傳統(tǒng)的釀造酒之一，“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色。麥曲在黃酒的釀造過程中發(fā)揮重要的作用，為黃酒的釀造提供多種復合酶、風味物質(zhì)。目前對于黃酒麥曲微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要集中于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和初步鑒定。應用PCR-DGGE技術分析黃酒麥曲中細菌微生物群落結(jié)構(gòu)的組成，對判斷和鑒定麥曲中的優(yōu)勢微生物、功能微生物具有重要的理論和實踐意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法存在的問題，利用變性梯度凝膠電泳技術檢測黃酒麥曲中細菌微生物群落結(jié)構(gòu)。本發(fā)明不依賴傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)，利用適合DGGE分離的細菌通用引物，結(jié)合PCR-DGGE技術分析黃酒麥曲中的優(yōu)勢細菌和功能微生物。本方法具有簡便、快捷、重復性好等特點，結(jié)合傳統(tǒng)的分離方法能夠更加全面的反應麥曲中的細菌微生物群落結(jié)構(gòu)組成，為研究黃酒麥曲的功能微生物提供有力的證明。

本發(fā)明的技術方案：利用氯化芐法提取黃酒麥曲樣品的基因組DNA，PCR擴增細菌的16S?rDNA?V3區(qū)，DGGE電泳分離DNA片段，切膠回收微生物對應的條帶，二次PCR擴增及T-克隆和挑選陽性克隆子，DGGE電泳條帶比對，測序鑒定切膠條帶對應的微生物。

本發(fā)明通過PCR-DGGE技術檢測黃酒麥曲中細菌微生物群落結(jié)構(gòu)，可廣泛用于分析不同工藝、不同地區(qū)的黃酒麥曲樣品及同一種黃酒麥曲樣品制作過程中細菌微生物群落結(jié)構(gòu)變化的規(guī)律，為功能微生物的分離鑒定提供參考。

具體實施方法

實施例1基因組DNA提取

稱取1.0g麥曲樣品放入10mL離心管中，同時加入2.5mL提取液(100mmol/L?Tris-HCl，pH8.0，40mmol/L?EDTA，pH8.0)振蕩混勻后，再加入1mL10％SDS和2mL氯化芐，50℃保溫1h(每10min上下顛倒混勻)，加入1mL?3mol/L的NaAc，冰浴15min，12,000r/min離心15min，取上清，加入等體積的異丙醇，-20℃放置2h，12,000r/min離心15min，棄上清，加入70％乙醇洗滌，離心15min，棄上清，待乙醇揮發(fā)完后加入50μL?TE溶解。

實施例2PCR-DGGE分析

設計擴增細菌16S?rDNA?V3區(qū)的引物對，并在正向引物的5’端加上GC夾；引物是：F1：

5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’