[發明專利]對氯化鈉耐受的地衣芽孢桿菌的篩選方法

有效

• 申請號: 201110222042.6
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102344895A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 李寶成;尹川;馮作山;梁玉偉;解麗娟
• 申請（專利權）人: 雙贏集團有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/10
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 劉洪勛;徐麗維

技術領域

本發明屬于微生物領域，涉及一種地衣芽孢桿菌(Bacillus?licheniformis)的篩選馴化方法以及得到的地衣芽孢桿菌，是應用于肥料中提高地衣芽孢桿菌對鹽的耐受性。

背景技術

地衣芽孢桿菌，拉丁學名Bacillus?licheniformis，是芽孢桿菌屬的一種。單地衣芽孢桿菌細胞形態和排列呈桿狀、單生，能產生抗活性物質，并具有獨特的生物奪氧作用機制，能抑制致病菌的生長繁殖。

地衣芽孢桿菌能夠抑制土壤中病原菌的繁殖和對植物根部的侵襲，減少植物土傳病害，預防多種害蟲爆發，因此被應用于肥料中。例如CN101955903A公開的“一種地衣芽孢桿菌及其應用”，CN101891548A公開的“一種三株地衣芽孢桿菌制作的多效微生物菌肥”，上述文獻均涉及了地衣芽孢桿菌在肥料中的應用。然而，由于地衣芽孢桿菌對鹽的耐受性較差，高濃度的鹽能夠抑制菌株。因此，目前地衣芽孢桿菌均是用于生物有機肥，或低含鹽里的復合肥。這限制了地衣芽孢桿菌在肥料中的應用。而化肥主要成分為無機鹽，使得將地衣芽孢桿菌與化肥混用時大部分地衣芽孢桿菌不能存活。

發明內容

本發明的目的就在于提供一種對氯化鈉耐受的地衣芽孢桿菌的篩選方法。

本發明采用如下技術方案：一種對氯化鈉耐受的地衣芽孢桿菌的篩選方法，包括如下過程：

(1)篩選：將地衣芽孢桿菌CGMCC?1.0518，以營養瓊脂為培養基，先進行試管斜面培養，然后再進行培養皿斜面劃線培養后篩選出典型的地衣芽孢桿菌的單菌落；將典型的地衣芽孢桿菌轉入營養瓊脂試管斜面，進行培養；

(2)馴化：在營養瓊脂培養基里增加氯化鈉，制成氯化鈉濃度不同的培養皿，把步驟(1)中最后培養得到的地衣芽孢桿菌先在磷酸氨二銨濃度較低的培養皿中劃線培養；將培養的單菌落轉移到試管斜面培養后作為菌種，再在下一個氯化鈉濃度較高的培養皿中劃線培養，以此類推，逐步提高氯化鈉濃度，篩選出能夠耐受較高濃度氯化鈉的地衣芽孢桿菌。

所述步驟(2)中氯化鈉質量濃度可以分別為2％、5％、8％、10％、12％、12.5％、13％和15％。

所述營養瓊脂組成為：每1000ml水用蛋白胨10克、牛肉粉3.0克和氯化鈉5.0克，pH值為7.3±0.1。

各步驟中所述培養條件為恒溫培養箱中34℃±0.5℃培養3-5天。

一種用上述方法篩選馴化得到的耐鹽的地衣芽孢桿菌，為革蘭氏陽性細菌，桿長2.5-3.5μm，桿寬0.8-1.5μm，產生近中生的橢圓狀芽孢，孢囊稍膨大；細胞形態和排列呈桿狀、單生；無莢膜，無鞭毛，能運動；細胞內無聚-β-羥基丁酸鹽在普通瓊脂平板上極易生長，菌落形態為扁平、邊緣不整齊、白色、表面粗糙皺褶；地衣芽孢桿菌可產生乙酰甲基甲醇，兼營性厭氧生活；可分解葡萄糖、甘露醇及木糖產酸，但不能分解阿拉伯糖產酸；石蕊牛奶呈還原胨化反應，能分解淀粉和酪素，能利用檸檬酸鹽；耐受質量濃度為12.5％的氯化鈉。

本發明的方法得到的地衣芽孢桿菌，通過篩選、馴化，在質量濃度為20％的氯化鈉營養瓊脂中生長良好，表明能夠耐受質量濃度為20％的氯化鈉。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明作進一步詳細描述，以助于理解本發明的內容。

地衣芽孢桿菌Bacillus?licheniformis來源，中科院微生物所的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購買，編號為1.0518。

所用分離基礎培養基：營養瓊脂培養基

蛋白胨：10克

牛肉粉：3.0克

氯化鈉：5.0克

水：1000ml

pH值：7.3±0.1

篩選馴化方法：

(1)準備：按照營養瓊脂培養基標準配制好培養基，連同包好的培養皿、試管培養基、無菌水、玻璃刮刀、移液管等輔助器具，經過高溫滅菌后待用。滅好菌的營養瓊脂培養基倒平板，試管培養基擺斜面，冷卻，備用。

(2)復壯：超凈工作臺開紫外燈滅菌30分鐘，實驗室甲醛熏蒸，準備工作做好后，吸0.2毫升的無菌水加入凍干管中，將地衣芽孢桿菌菌種干粉做成菌懸液，在火焰封口的狀態下倒入制備好的試管斜面上，將菌懸液平鋪在斜面培養基上，放入恒溫培養箱中34℃±0.5℃，培養3-5天。鏡檢觀察形態，芽孢率。