[發明專利]對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法

有效

• 申請號: 201110222039.4
• 申請日: 2011-08-04
• 公開（公告）號: CN102344893A
• 公開（公告）日: 2012-02-08
• 發明（設計）人: 解麗娟;尹川;李寶成;馮作山
• 申請（專利權）人: 雙贏集團有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12R1/125
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 劉洪勛;徐麗維

技術領域

本發明屬于微生物領域，涉及一種枯草芽孢桿菌(Bacillus?subtilis)的篩選馴化方法以及得到的枯草芽孢桿菌，是應用于肥料中提高枯草芽孢桿菌對磷酸氫二銨的耐受性。

背景技術

枯草芽孢桿菌，拉丁學名Bacillus?subtilis，是芽孢桿菌屬的一種。單個細胞0.7～0.8×2～3微米，著色均勻。無莢膜，周生鞭毛，能運動。革蘭氏陽性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黃色，在液體培養基中生長時，常形成皺醭。需氧菌。在遺傳學研究中應用廣泛，對此菌的嘌呤核苷酸的合成途徑與其調節機制研究較清楚。廣泛分布在土壤及腐敗的有機物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

枯草芽孢桿菌具有解磷作用，能夠提高磷的植物利用度，因此被應用于肥料中。例如CN101899405A公開的“枯草芽孢桿菌GU及其在制備高效生物復合磷肥中的應用”，CN101643710A公開的“一株枯草芽孢桿菌及其應用”，CN101200385A公開的“用側孢芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌制備復合微生物肥料”，上述文獻均涉及了枯草芽孢桿菌在肥料中的應用。然而，由于枯草芽孢桿菌對鹽的耐受性較差，高濃度的鹽能夠抑制菌株。例如楊清香、曹衛軍在《武漢大學學報(自然科學)》1998年02期“高滲環境對枯草芽孢桿菌和粘質沙雷氏菌胞內自由氨基酸庫含量和組成的影響”一文中，公開有枯草芽孢桿菌(93151和93215)可耐受8％NaCl。因此，目前枯草芽孢桿菌均是用于生物有機肥，或低含鹽里的復合肥。這限制了枯草芽孢桿菌在肥料中的應用。

磷酸氫二銨，是一種能夠為植物提供氮和磷的常用化肥。因此，提供一種耐磷酸氨二銨的枯草芽孢桿菌，使其能夠與磷酸氫二銨合用，以利用枯草芽孢桿菌促進磷酸氫二銨肥效的發揮，成為肥料行業需要解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的就在于提供一種對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法。

本發明采用如下技術方案：一種對磷酸氫二銨耐受的枯草芽孢桿菌的篩選方法，包括如下過程：

(1)篩選：將枯草芽孢桿菌CGMCC?1.0769，以營養瓊脂為培養基，先進行試管斜面培養，然后再進行培養皿斜面劃線培養后篩選出典型的枯草芽孢桿菌的單菌落；將典型的枯草芽孢桿菌轉入營養瓊脂試管斜面，進行培養；

(2)馴化：在營養瓊脂培養基里增加磷酸氫二銨，制成磷酸氫二銨濃度不同的培養皿，把步驟(1)中最后培養得到的枯草芽孢桿菌先在磷酸氨二銨濃度較低的培養皿中劃線培養；將培養的單菌落轉移到試管斜面培養后作為菌種，再在下一個磷酸氫二銨濃度較高的培養皿中劃線培養，以此類推，逐步提高磷酸氫二銨濃度，篩選出能夠耐受較高濃度磷酸氫二銨的枯草芽孢桿菌。

所述步驟(2)中磷酸氫二銨質量濃度可以分別為10％、15％、20％和25％。

所述營養瓊脂組成為：每1000ml水用蛋白胨10克、牛肉粉3.0克和氯化鈉5.0克，pH值為7.3±0.1。

各步驟中所述培養條件為恒溫培養箱中34℃±0.5℃培養3-5天。

本發明的方法得到的枯草芽孢桿菌，通過篩選、馴化，在質量濃度為20％的磷酸氫二銨營養瓊脂中生長良好，表明能夠耐受質量濃度為20％的磷酸氫二銨。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發明作進一步詳細描述，以助于理解本發明的內容。

枯草芽孢桿菌subsp.subutilis來源，中科院微生物所的中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)購買，編號為1.0769。

所用分離基礎培養基：營養瓊脂培養基

蛋白胨：10克

牛肉粉：3.0克

氯化鈉：5.0克

水：1000ml

pH值：7.3±0.1

篩選馴化方法：

(1)準備：按照營養瓊脂培養基標準配制好培養基，連同包好的培養皿、試管培養基、無菌水、玻璃刮刀、移液管等輔助器具，經過高溫滅菌后待用。滅好菌的營養瓊脂培養基倒平板，試管培養基擺斜面，冷卻，備用。

(2)復壯：超凈工作臺開紫外燈滅菌30分鐘，實驗室甲醛熏蒸，準備工作做好后，吸0.2毫升的無菌水加入凍干管中，將枯草芽孢桿菌菌種干粉做成菌懸液，在火焰封口的狀態下倒入制備好的試管斜面上，將菌懸液平鋪在斜面培養基上，放入恒溫培養箱中34℃±0.5℃，培養3-5天。鏡檢觀察形態，芽孢率。